結(jié)直腸癌中VASP表達(dá)及與轉(zhuǎn)移關(guān)系研究

黨運(yùn)芝 于嬌 趙淑紅 金龍 任曉躍 王青

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率位列第三，死亡率位列第三［1］。手術(shù)切除是CRC最有效的治療方式，但是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是手術(shù)治療失敗的主要原因［2］。另外，約20%的結(jié)直腸癌患者在診斷時(shí)已出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移［3］。盡管近年來CRC治療方法取得了顯著進(jìn)步，但轉(zhuǎn)移性CRC可選擇的有效治療方式仍較少［4-5］，目前關(guān)于CRC轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不清楚，亟待進(jìn)一步研究。VASP是Ena/VASP家族的一個(gè)重要成員，可調(diào)節(jié)actin細(xì)胞骨架運(yùn)動及細(xì)胞遷移［6-8］。過表達(dá)的VASP可促進(jìn)多種腫瘤的侵襲和遷移，且與差的預(yù)后呈正相關(guān)［9-11］。但關(guān)于VASP在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和功能報(bào)道較少。本研究檢測了VASP表達(dá)，并分析了VASP表達(dá)量與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索了VASP在CRC轉(zhuǎn)移中的作用。

材料與方法

一、細(xì)胞系和人組織標(biāo)本

人結(jié)腸永生化細(xì)胞CRL1 790，人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、S1226、DLD-1、RKO、Caco-2、SW620、LoVo、SW48、T84和Colo201引自美國模式菌種細(xì)胞庫（ATCC），由陜西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室組織細(xì)胞庫保存。

二、熒光定量PCR

用Takara試劑盒提取新鮮組織的RNA，用Takara試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，后行熒光定量PCR。反應(yīng)程序如下：95°C，15s；55-60 °C，15s；72°C，15 s共45個(gè)循環(huán)。用如下公式計(jì)算樣本的表達(dá)量：2–ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCtTumor– ΔCtNontumor）。

VASP的引物序列如下：

正向：5'-ATGGCAACAAGCGATGGCT-3'

反向：5'-CGATGGCACAGTTGATGACCA-3'

三、免疫組化

結(jié)腸癌及癌旁組織芯片，65℃烤片3～4 h，常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鈉（pH=6.0）高壓修復(fù)2 min，冷卻至室溫后于3%H2O2封閉15 min。加入VASP（abcam，ab229624）一抗，4℃孵育過夜。第二天PBS漂洗3次×5 min后，滴加二抗，室溫孵育30 min。PBS漂洗3次×5 min后，滴加辣根過氧化物酶，室溫孵育30 min。PBS漂洗3次×5 min，DAB顯色，脫水透明，中性樹脂封片。

免疫組化評分由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立完成，免疫染色強(qiáng)度分為0～3分：0（陰性），1（弱陽性），2（中度陽性），3（強(qiáng)陽性）。細(xì)胞陽性率分5個(gè)級別：0（陰性），1（1%～25%），2（26%～50%），3（51%～75%），4（76%～100%）。最終得分為免疫染色強(qiáng)度與細(xì)胞陽性率的乘積。其中0～3為陰性，4～12分為陽性。

四、蛋白免疫印跡

用中等強(qiáng)度的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑）提取細(xì)胞蛋白，用SDS-PAGE凝膠電泳1.5～2.0 h，轉(zhuǎn)至PVDF膜上（恒壓25 V，30 min），10%牛奶室溫封閉1 h。一抗VASP（abcam，b229624）孵育，4℃過夜。第二天，TBST漂洗5 min×3次，二抗室溫孵育30 min。采用Bio-Rad公司的ChemiDocXRS凝膠成像儀成像。

五、Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

選用corning公司24孔小室（直徑為8 μm）。在遷移實(shí)驗(yàn)中，5×105細(xì)胞種植在無血清的上室內(nèi)；在侵襲實(shí)驗(yàn)中，5×105細(xì)胞被種植在無血清且基質(zhì)膠包被的上室，下室均加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)基。24～48 h后分別取出小室，用4%多聚甲醛固定10 min，7%的結(jié)晶紫染色10 min，倒置顯微鏡拍照，分析細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的數(shù)目。

六、裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

BALB/C裸鼠，雄性，4～6周齡，購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)在SPF級別動物房中。將相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，收取細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將裸鼠隨機(jī)分組（n=10），每只裸鼠尾靜脈注射200 μL細(xì)胞懸液（約5×105個(gè)細(xì)胞），后每周行活體成像，9周后處死全部小鼠。

七、數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值均記為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。數(shù)值變量采用Student t檢驗(yàn)，分類變量采用卡方（χ2）檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、VASP高表達(dá)與結(jié)直腸癌較差的預(yù)后相關(guān)

我們首先用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測了VASP在20例正常腸上皮組織及110例配對的癌旁及CRC組織中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)VASP的表達(dá)水平在CRC組織中較癌旁及正常組織明顯升高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)VASP的表達(dá)水平在復(fù)發(fā)CRC（n=59）的表達(dá)較沒有復(fù)發(fā)的CRC（n=51）升高更為顯著。在轉(zhuǎn)移的CRC（n=53）較無轉(zhuǎn)移CRC（n=45）的升高更為顯著（圖1A）。在20對配對的標(biāo)本中，VASP在轉(zhuǎn)移性CRC中的表達(dá)明顯高于原發(fā)性CRC（圖1A～1B）我們進(jìn)一步用免疫組化方法分析了VASP在222對配對CRC組織與癌旁組織中的表達(dá)。我們選取了222例均接受手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者，其中130例患者只接受了手術(shù)治療；60例患者接受了手術(shù)+化療；32例患者接受了手術(shù)+放療+化療。發(fā)現(xiàn)VASP主要為胞質(zhì)著色，且VASP在CRC中的表達(dá)明顯高于癌旁（圖1C）。VAS與腫瘤大小、腫瘤分化、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、AJCC分期呈正相關(guān)（表1）。COX多因素分析表明VASP的表達(dá)是結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)及死亡的獨(dú)立預(yù)測因素之一（表2）。而生存分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的VASP與短的總體生存（χ2=62.4，P＜0.001）及高的復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)（χ2=66.9，P＜0.001）（圖1D）。

表1 結(jié)直腸患者中VASP的表達(dá)與臨床參數(shù)的相關(guān)性

表2 VASP的表達(dá)是結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)及死亡的獨(dú)立預(yù)測因素

圖1 VASP在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。1A：實(shí)時(shí)定量PCR方法分析正常腸上皮組織、癌旁及CRC組織中VASP mRNA的表達(dá)水平；復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)CRC患者VASP mRNA的表達(dá)；轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移CRC患者VASP mRNA的表達(dá)；20對配對的正常腸上皮組織、原發(fā)CRC及轉(zhuǎn)移CRC中VASP mRNA的表達(dá)。1B：IHC檢測VASP在20例配對的癌旁，原發(fā)性CRC及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移CRC的表達(dá)情況。1C：IHC染色分析VASP在癌旁及CRC的蛋白表達(dá)情況及IHC評分情況。1D：Kaplan-Meier方法分析VASP的表達(dá)與復(fù)發(fā)及生存的關(guān)系。低倍鏡圖中bar值代表250 μm，高倍鏡圖中bar值為50 μm。*P＜0.05

二、VASP過表達(dá)促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移

為進(jìn)一步研究VASP在CRC中的功能，我們首先檢測了正常腸上皮、結(jié)腸永生化細(xì)胞及10種CRC細(xì)胞系中VASP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SW620細(xì)胞中VASP的表達(dá)最低，而SW480細(xì)胞中VASP的表達(dá)最高（圖2A）。因此，我們用慢病毒感染的方法建立兩個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞株：SW480-VASP和SW620-shVASP（圖2B）。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組細(xì)胞相比，上調(diào)VASP表達(dá)可促進(jìn)SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力，而下調(diào)VASP的表達(dá)可以抑制SW620細(xì)胞的侵襲和遷移（圖2C）。

圖2 VASP可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。2A：VASP在正常腸上皮、結(jié)腸永生化細(xì)胞及10種CRC細(xì)胞系中的表達(dá)；2B：慢病毒轉(zhuǎn)染后VASP在相應(yīng)細(xì)胞中的表達(dá)；2C：Transwell實(shí)驗(yàn)分析SW480-VASP，SW620-shVASP與相應(yīng)對照組細(xì)胞的侵襲和遷移能力

三、裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)VASP過表達(dá)可促進(jìn)CRC細(xì)胞系的肺轉(zhuǎn)移

為進(jìn)一步研究VASP在CRC中的功能，我們將SW480-VASP及SW620-shVASP細(xì)胞及其相應(yīng)對照組細(xì)胞分別注射到小鼠的尾靜脈，并每周成像一次。生物活體成像發(fā)現(xiàn)VASP過表達(dá)可增加SW480細(xì)胞的信號強(qiáng)度，而下調(diào)VASP的表達(dá)可降低SW620細(xì)胞的信號強(qiáng)度（圖3A～3B）。HE染色發(fā)現(xiàn)VASP過表達(dá)可以增加SW480細(xì)胞肺臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生率及轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，而下調(diào)VASP的表達(dá)則可以降低SW620細(xì)胞肺臟轉(zhuǎn)移的發(fā)生率及轉(zhuǎn)移灶數(shù)目（圖3C～3E）。而生存分析發(fā)現(xiàn)VASP過表達(dá)可以降低小鼠總體生存時(shí)間，而下調(diào)VASP的表達(dá)則可以延長小鼠總體生存時(shí)間（圖3F）。

圖3 VASP可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。3A：生物發(fā)光成像顯示各組裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移情況；3B：各組裸鼠尾靜脈注射后0～9周活體成像的信號值；3C：各組裸鼠肺部代表性的HE圖像；3D：各組裸鼠肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率；3E：各組裸鼠肺臟轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目；3F：各組裸鼠的總體生存。*P＜0.05

討 論

Ena/VASP蛋白是一個(gè)保守的actin調(diào)節(jié)蛋白家族，由EVH1、EVH2和一個(gè)富含脯氨酸蛋白的區(qū)域組成。近年來的研究表明，VASP在多種腫瘤中亦具有重要作用。在肝細(xì)胞癌中，VASP的表達(dá)水平明顯升高，與門靜脈癌栓形成及不良預(yù)后呈正相關(guān)［12］。肝臟是結(jié)腸癌最常見的轉(zhuǎn)移器官，在小鼠肝臟轉(zhuǎn)移模型及腫瘤患者中，結(jié)腸癌細(xì)胞到達(dá)肝竇并上調(diào)肝臟星形細(xì)胞的VASP表達(dá)，VASP促進(jìn)肝臟星形細(xì)胞向腫瘤相關(guān)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化［9］。乳腺癌中，Wnt/β-catenin信號通路與VASP形成正反饋環(huán)路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［13］。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，VASP在肝細(xì)胞癌中表達(dá)明顯升高，轉(zhuǎn)錄因子HOXC10通過上調(diào)VASP的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移［14］。而食管癌中，VASP的239位點(diǎn)磷酸化則可抑制腫瘤的侵襲和遷移［15］。

臨床病理學(xué)特征在預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后，選擇合理治療方案上具有重要作用［16］。但目前關(guān)于VASP在結(jié)直腸癌中表達(dá)報(bào)道還較少，且結(jié)論相互矛盾。在既往的文獻(xiàn)中［17］發(fā)現(xiàn)VASP的過表達(dá)及磷酸化與CRC疾病的復(fù)發(fā)呈正相關(guān)。另外，在60例結(jié)腸癌中VASP的過表達(dá)與不良預(yù)后呈正相關(guān)［18］。但另一篇只有20例CRC的研究中則發(fā)現(xiàn)VASP及兩種磷酸化VASP的表達(dá)水平在癌組織顯著低于癌旁組織［19］。本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR及免疫組化染

色的方法發(fā)現(xiàn)VASP在CRC中的表達(dá)較癌旁明顯升高。VASP與AJCC分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，是CRC患者復(fù)發(fā)及死亡的獨(dú)立預(yù)測因素之一。另外，在20例配對的樣本中，我們發(fā)現(xiàn)VASP在轉(zhuǎn)移性CRC組織中的表達(dá)顯著高于原發(fā)CRC組織中的表達(dá)，基于此我們對VASP在CRC轉(zhuǎn)移中的作用進(jìn)行了進(jìn)一步探索。首先體外細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上調(diào)VASP的表達(dá)可促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移，而下調(diào)VASP的表達(dá)則可以抑制CRC細(xì)胞的侵襲和遷移。體內(nèi)的裸鼠尾靜脈實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)的VASP可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，是促進(jìn)CRC進(jìn)展的重要分子。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)VASP在CRC中表達(dá)升高與差的預(yù)后呈正相關(guān)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明VASP可促進(jìn)CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究明確了VASP在CRC中的表達(dá)和功能，為臨床治療CRC轉(zhuǎn)移提供潛在的靶點(diǎn)，但VASP促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。