一株諾卡氏菌的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及治療方案探討

王友娟，徐 祥，尹懷磊，李 華，夏 偉，張 浩，冷敦鵬

(1.青島中仁動(dòng)物藥品有限公司，山東 青島 266329；2.膠州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島 266329)

目前我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物結(jié)節(jié)病的發(fā)生呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)烏鱧(Snakehead)、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)、羅非魚(Tilapiamossambica)、高體(Serioladumerili)、鱸等經(jīng)濟(jì)魚類造成巨大危害(范寧寧，2018)。其中引起烏鱧類結(jié)節(jié)病的病原有諾卡氏菌、舒氏氣單胞菌、類立克次氏體和分枝桿菌等(唐國(guó)盤，1982)。對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物結(jié)節(jié)病病原及其藥物敏感性的研究，有利于水產(chǎn)科研工作者和一線養(yǎng)殖者了解掌握疾病的發(fā)生規(guī)律，從而為疫病的防控提供依據(jù)，為藥物的合理使用提供參考。

2020年11月安丘市坊子區(qū)劉姓養(yǎng)殖戶池塘飼養(yǎng)的烏鱧發(fā)生間斷死亡，病魚可見體色偏黑、反應(yīng)遲鈍、乏力、浮游于水面，體表有損傷并潰爛出血，嚴(yán)重者鱗片脫落、潰爛并形成較大的膿腫。為了盡快弄清病因，找到有效可行的防治方法，筆者對(duì)其病原及防治藥物進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

(1)病魚來源：病魚于2020年11月采自安丘市，體長(zhǎng)30～35厘米，個(gè)體重2～2.5千克。

(2)試劑耗材：胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，110毫米直徑定性濾紙購(gòu)自杭州新華紙業(yè)有限公司，10%鹽酸多西環(huán)素可溶性粉、5%硫酸新霉素粉、10%氟苯尼考可溶性粉、5%恩諾沙星粉、10%磺胺間甲氧嘧啶鈉粉及30%阿莫西林可溶性粉由青島中仁動(dòng)物藥品有限公司生產(chǎn)。

(3)主要儀器設(shè)備：震蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F160)、恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052)和細(xì)菌濁度儀(WGZ-XT)。

2.試驗(yàn)方法

(1)臨床癥狀及剖檢：首先調(diào)查發(fā)病池塘水溫、病魚的魚齡、苗種來源、病魚在養(yǎng)殖池中的活動(dòng)情況、死亡率等，并在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行解剖和觀察，記錄病魚體外和體內(nèi)的臨床癥狀。

(2)寄生蟲檢查：分別取少量魚體表黏液及鰓絲于載玻片上，加1滴無菌生理鹽水，展開后用顯微鏡進(jìn)行鏡檢。

(3)病原菌分離、鑒定：在無菌條件下，分別從病魚的肝臟、腎臟組織中接菌，于TSA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)5～7天，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢(shì)菌落在TSA平板上多次劃線純化，直至得到形態(tài)一致、特征穩(wěn)定的菌落，將純分離物平板送至華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行分子鑒定和測(cè)序。

(4)藥敏紙片制作：為了節(jié)約藥敏試驗(yàn)成本，藥敏紙片自制，方法參照張浩(2018)和王傳峰(2015)等的方法。利用打孔器將110毫米的定性濾紙打成直徑為6毫米的圓形小紙片，放入清潔干燥的青霉素空瓶中，每瓶放入50片，用牛皮紙包好瓶口并用小線扎緊，高壓滅菌(121℃，15分鐘)，烘干，密封備用。抗菌藥物的濃度統(tǒng)一選擇100毫克/升，配置好后過濾除菌，然后吸取無菌藥液1毫升加入裝有紙片的青霉素瓶中，用牛皮紙密封瓶口，浸泡1小時(shí)，讓藥液被紙片充分吸凈，空白對(duì)照采用無菌雙蒸水按照同樣方法制得；然后將紙片散開放入滅菌的培養(yǎng)皿中，無菌室擱置過夜，待紙片完全干燥后，收集在青霉素瓶?jī)?nèi)，密封，貼好標(biāo)簽，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)藥敏試驗(yàn)：藥物敏感性試驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，參照何晟毓(2020)的方法并略有改動(dòng)。將分離純化的病原菌接種于TSA液體培養(yǎng)基，28℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)4～7天，將菌液用微量電動(dòng)組織混勻器充分混勻后吸取200微升，參照麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度為1.8×108CFU/毫升，在無菌環(huán)境下均勻涂布于整個(gè)平板。待培養(yǎng)基表面干燥后放置藥敏紙片使其緊貼培養(yǎng)基表面，28℃恒溫箱中培養(yǎng)3～7天，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量、記錄抑菌圈直徑大小，根據(jù)抑菌圈直徑大小粗略判斷同等濃度下不同藥物的敏感性。

二、結(jié)果

1.臨床癥狀及剖檢結(jié)果

病魚體表呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀潰瘍、膿瘡或出血，部分病魚眼睛外凸，腹部異常腫大，解剖可見大量血性腹水，脾臟、腎臟、肝臟內(nèi)外布滿直徑2～5毫米的黃白色結(jié)節(jié)，尤以腎臟最為嚴(yán)重，在后腎處形成巨大的囊腫物，部分病魚按壓皮膚會(huì)流出膿血(圖1)。鏡檢未見寄生蟲感染。

圖1 病魚體外和體內(nèi)臨床癥狀

2.細(xì)菌分離

將劃線接種的TSA平板經(jīng)28℃恒溫培養(yǎng)4天后才有少許菌落生長(zhǎng)。從患病烏鱧肝臟、腎臟、脾臟均分離得到同一種形態(tài)的優(yōu)勢(shì)菌，呈淡黃色沙粒狀，菌落呈不規(guī)則凸起(圖2)。將其命名為菌株ZRWL-16。

圖2 分離菌在TSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

3.菌種鑒定結(jié)果

NCBI-BLAST比對(duì)顯示，該株分離菌與Nocar-diaseriolaeUTF1(登錄號(hào)為AP017900.1)序列相似性為99.72%，最終鑒定ZRWL-16菌株為諾卡氏菌。

4.藥敏試驗(yàn)

分離菌ZRWL-16在TSA瓊脂上生長(zhǎng)良好，28℃培養(yǎng)96小時(shí)后能清楚判斷抑菌圈大小(圖3)。

圖3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

同等濃度下，該株諾卡氏菌對(duì)藥物的敏感性從高到低依次為10%鹽酸多西環(huán)素可溶性粉、10%氟苯尼考可溶性粉、10%磺胺間甲氧嘧啶鈉、5%恩諾沙星和5%硫酸新霉素，抑菌圈直徑分別為20.35、18.60、16.52、15.25、13.20毫米。

5.治療方案

確診為諾卡氏菌感染后，筆者推薦養(yǎng)殖戶使用內(nèi)服加外消的方法(抗菌＋提高免疫力＋修復(fù)肝臟損傷)進(jìn)行治療。建議先給烏鱧減料，使用聚維酮碘溶液對(duì)水體進(jìn)行消毒，用量按說明書所示，隔1天用1次，進(jìn)行1～2次，同時(shí)拌料內(nèi)服“鹽酸多西環(huán)素(或氟苯尼考)＋黃芪多糖＋肝膽康泰”，用量按具體產(chǎn)品說明，連續(xù)投喂7天，每天投喂1餐，并結(jié)合使用過硫酸氫鉀產(chǎn)品連續(xù)改底兩次。劉老板按照這個(gè)方案使用了5天，死魚明顯減少，8天后只有零星死亡，病情基本得到了控制。

三、討論

由于諾卡氏菌為革蘭氏陽性菌，臨床上對(duì)革蘭氏陽性菌敏感的藥物不多，且該菌生長(zhǎng)緩慢，潛伏期長(zhǎng)，易在體內(nèi)形成結(jié)節(jié)，導(dǎo)致治療難度大(何晟毓等，2020；胡雄等，2019)。目前對(duì)該病的防治依賴于抗菌藥物，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，該病病原對(duì)鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考等較敏感。但在不同地域、不同養(yǎng)殖品種、不同養(yǎng)殖管理模式下，病原的藥物敏感譜會(huì)有所不同。耐藥性的增加和藥物本身的副作用可能會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物肝腎損傷，因此建議在選擇敏感藥物進(jìn)行治療的同時(shí)，搭配可以促進(jìn)肝臟分泌膽汁、增強(qiáng)肝臟解毒和排毒功能的膽汁酸，或具有保肝護(hù)肝、調(diào)節(jié)免疫力、清熱解毒的中草藥提取物及消除應(yīng)激的維生素等。最后，也是最重要的一條，一定要增強(qiáng)病害防控意識(shí)，做到“預(yù)防為主、防重于治”，并對(duì)癥用藥。