土霉素原料藥中N-亞硝基二甲胺雜質檢查方法的分析探討

郝麗霞，智 越，陳倩倩，李 惠

(巴彥淖爾市產品質量計量檢測中心,內蒙古 巴彥淖爾 015000)

N-亞硝基二甲胺(C2H6N2O,NDMA)是亞硝胺類化合物的一種,在環境中廣泛存在。經消化道、呼吸道吸收迅速,經皮膚吸收緩慢。經現代研究證實,被認定為具有遺傳毒性的物質,明確列入世界衛生組織國際癌癥研究機構在2017年10月27日公布的致癌物清單中[1-2]。基因毒性雜質在痕量即可引起細胞產生基因突變或體內誘變。NDMA幾乎可以引發人體所有臟器腫瘤, 靶器官主要為肝和腎。關于NDMA,最早引起轟動的是2013的“復旦大學投毒案”；2018年又一次進入醫藥行業的視野,是因為國家藥監局通報華海藥業纈沙坦原料藥中存在NDMA殘留,也由此,業界更加關注NDMA雜質的檢測和分析。NDMA可由二甲胺與亞硝酸鹽在酸性條件下反應而生成。二甲胺和亞硝酸都是常用的制藥原料,生產過程中如果出現吻合條件,就有可能在終端產品中形成殘留,因此,建立準確可靠的檢驗方法,考查評價產品質量是保證藥品安全有效的手段。

土霉素是四環素類抗生素,為廣譜抑菌劑,許多立克次體屬、支原體、衣原體等微生物對該品敏感,在上個世紀六七十年代,土霉素在臨床用藥中占有舉足輕重的地位。隨著醫藥技術的進步,更多抗生素藥物被研制成功,替代品推陳出新。土霉素生產過程包括發酵、酸化過濾、脫色結晶、離心干燥等環節,各環節所用培養基、酸化劑等工藝輔料以及環境,都有可能潛在痕量的NDMA。目前,獲得國家藥品監管部門批準的土霉素原料藥和制劑文號仍然保存有700余個,尤其是原料藥的出口有更嚴格要求,因此,對于該品種質量評價的研究依然重要。

1 材料與試驗條件

1.1 儀器與試劑試藥

7890B氣相色譜儀；7010質譜儀；LPD2500多管旋渦；OM-INNOWAXms色譜柱(30mm×0.25mm×0.25μm)；HC-3018R高速冷凍離心機；氦氣和氮氣(純度99.999%)；N-亞硝基二甲胺標準溶液(批號：S070533,規格1000μg/mL)；乙腈(批號：20210222,純度99.9%)。

1.2 氣相色譜條件

色譜柱：OM-INNOWAXms色譜柱(30mm×0.25mm,0.25μm)；程序升溫：初始柱溫為40℃,保持0.5分鐘,以每分鐘20℃的速率升溫至200℃；再以每分鐘60℃速率升溫至240℃,保持5分鐘；進樣口溫度250℃；進樣體積1.0μL；進樣模式：不分流進樣,不分流時間0.75min；恒壓模式,壓力7.0699psi。

1.3 質譜條件

離子源：電子轟擊離子源(EI)電壓為70eV；傳輸線溫度：250℃；離子源溫度：250℃；碰撞氣：氮氣；增益因子：1；溶劑延遲2.5min；檢測模式：MRM；定量離子對：74.1→44.1；碰撞能：6V；定性離子對：74.1→42.1,碰撞能量：17V。

2 對照溶液與供試溶液制備

2.1 對照溶液制備

精密量取N-亞硝基二甲胺標準溶液適量,用乙腈稀釋定容制成1000ng/mL的溶液,作為標準儲備溶液。取上述標準儲備溶液適量,用乙腈逐級稀釋制得系列標準曲線溶液,濃度依次為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0ng/mL；(試驗中用二氯甲烷作為首選溶劑,因出峰不穩定,故調整為乙腈)

2.2 供試溶液制備

精密稱取原料藥約500mg,置50mL具蓋離心管中,精密加入乙腈5.0mL,旋渦5min,以5000r/min(4℃)離心5min,取上清液適量,以0.45μm濾膜過濾,取續濾液,作為供試品溶液。

3 測定方法

分別取對照品系列溶液和供試品溶液進樣測定,記錄譜圖。

4 驗證試驗

4.1 專屬性試驗

分別對乙腈溶劑空白、N-亞硝基二甲胺標準溶液及供試品溶液進行測定,記錄譜圖,結果顯示專屬性良好。詳見圖1～圖3。

圖1 乙腈溶劑空白譜圖

圖2 N-亞硝基二甲胺標準溶液譜圖

圖3 供試品溶液譜圖

4.2 線性范圍

對系列標準曲線溶液分別進行測定,記錄譜圖。以濃度(x)為橫坐標對定量離子峰面積(y)為縱坐標進行繪制標準曲線,結果表明,N-亞硝基二甲胺在5.0～200ng/mL范圍內線性關系良好,相關系數r2為0.9997,線性關系良好。詳見圖4。

圖4 線性關系

4.3 儀器檢出限和定量限

根據標準曲線中系列標準溶液來分別計算N-亞硝基二甲胺的儀器檢出限和定量限濃度,檢出限為0.2722 ng/mL,定量限為0.9073 ng/mL。見表1。

表1 檢出限和定量限

4.4 重復性試驗

分別精密稱取原料藥約500mg共六份,分別精密量取加入標準溶液(1000 ng/mL)0.25mL,制成濃度為0.50mg/kg的平行六份進行測定,結果顯示N-亞硝基二甲胺的重復性及精密度試驗RSD值為1.97%。見表2。

表2 重復性試驗結果

4.5 回收率試驗

分別精密稱取原料藥約500mg共九份,分別精密加入標準溶液適量,制成3個濃度(0.10、0.25和1.00mg/kg)各三份,進行測定。結果顯示N-亞硝基二甲胺的平均回收率為112%,回收率RSD值為2.64%,方法準確定較高。見表3。

表3 回收率試驗結果

4.6 方法檢出限

根據驗證準確度的回收率試驗中,制備的最低加標濃度點的信噪比,計算得到方法檢出限,方法檢出限LOD(mg/kg)均值：0.0298 mg/kg。

5 結果判斷

以子離子對的m/z和色譜圖中的保留時間進行定性；同時按標準曲線法,以定量離子的峰面積計算含量。分別對不同生產企業的6批土霉素原料藥進行測定,結果顯示均未檢出N-亞硝基二甲胺。

6 結論

通過以上檢測數據,可見,采用GC-MS/MS法測定土霉素原料藥中N-亞硝基二甲胺化合物的測定,方法學驗證結果表明,方法操作簡便,結果準確,具有良好的應用前景,有助于原料監管要求和保障質量安全。