油梨根腐病病原菌的鑒定、生物學(xué)特性及室內(nèi)藥劑篩選

仇芳 徐剛 謝昌平 李希 鄭妃慶

摘 ?要：根腐病是油梨的毀滅性病害之一，該病害為害根部，引起根部變黑腐爛，嚴重時導(dǎo)致植株死亡。從發(fā)病典型的植株根部分離、純化菌株，并開展致病性測定、形態(tài)學(xué)特征和多基因位點（ITS、LSU和COXⅡ）系統(tǒng)發(fā)育樹分析相結(jié)合的病原菌鑒定。結(jié)果表明，引起海南油梨根腐病的病原菌為樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）。還研究了不同培養(yǎng)條件和10種藥劑對病原菌菌絲生長的影響。結(jié)果表明，病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長較好，最適生長溫度為28 ℃，最適pH為8，黑暗條件更適合病原菌的生長;烯酰嗎啉對病原菌的抑制作用最強，EC50為0.0929 ?g/mL。本研究結(jié)果為油梨根腐病的田間防控提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：油梨;根腐病;樟疫霉

中圖分類號：S436.67 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Root rot of avocado is one of the destructive diseases. The disease infects the root system of plants， causing serious black rot of roots， leading to the death of plants. The strain was isolated and purified from the roots of typical symptoms and identified by the pathogenicity test， morphological characteristics， and multi-loci （ITS， LSU， and COXⅡ） phylogenetic analyses methods. The result showed the root rot of avocado from Hainan was caused by Phytophthora cinnamomi. To clarify the biological characteristics and sensitivity to ten fungicides， the effects of different culture condition on the hypha growth of P. cinnamomi were determined， and the inhibitory activities of ten fungicides on P. cinnamomi were also studied. The results exhibited that PDA medium was the appropriate medium for hypha growth， the optimum temperature was 28 ℃， the suitable pH was 8， and continuous darkness condition was beneficial to hypha growth. The toxicity test showed that dimethomoph had the best inhibitory activity with EC50 of 0.0929 ?g/mL among the fungicides. The result could provide a theoretical basis for the field control of avocado root rot disease.

Keywords： avocado; root rot disease; Phytophthora cinnamomi

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.031

油梨（Persea americana Mill.）又名鱷梨、牛油果、酪梨和樟梨等，為樟科（Lauraceae）鱷梨屬（Persea），原產(chǎn)于中、南美洲，屬熱帶、亞熱帶常綠喬木果樹[1]。其果實營養(yǎng)豐富、風(fēng)味好，是一種高能低糖水果，可作為糖尿病人及減肥人群的保健食品。13世紀，墨西哥已開始種植油梨，20世紀初，國外開始將油梨作為商業(yè)性果樹廣泛種植[2]。我國于1918年開始引進種植，目前主要分布在廣東、福建、臺灣、云南、廣西和海南等省（區(qū)）[3]。

國內(nèi)外已報道的油梨病害有Phytophthora cinnamomi[4]、Armillaria tabescens、Papulaspora sp.和Ustulina sp.[5]引起的根腐病;Rosellinia neca-trix[6]、Raffaelea lauricola[7-8]、Verticillium alboa-trum[9]、P. citricola[10]、Neofusicoccum parvum[11-12]和P. palmivora[13]引起的莖部病害;Pseudomonas syringae[14]引起的樹皮潰瘍病;Pestalotiopsis sp.[15]引起的梢枯病;Botryosphaeria dothidea[16]、Pseudocercospora purpurea[17]、Lasiodiplodia theobromae[18]、Colletotrichum gloeosporioides、C. fructicola[19-20]和Pestalotiopsis sp.[21]引起的果實病害;Avocado sunblotch viroid[22-23]引起的日斑類病毒病。其中，根腐病是制約油梨產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要病害之一，而由樟疫霉引起的根腐病又是最嚴重的一種土傳病害，具有相當強的侵染能力，該病害嚴重時會導(dǎo)致整個油梨園毀滅[24]。1984年，Zentmyer[5]報道了引起油梨根腐病的病原菌為P. cinnamomi。1997年，謝光煜等[25]報道了廣西油梨根腐病的病原菌為P. cinnamomi。

2018年9月，筆者在海南省白沙黎族自治縣大嶺農(nóng)場附近的某種植基地發(fā)現(xiàn)一種為害油梨根部的病害。該病害最初從根尖侵染，逐漸向側(cè)根、主根和莖基部擴展，最終導(dǎo)致植株死亡，發(fā)病率為5%～10%。本研究對該病害進行田間癥狀描述和病原菌分離純化、鑒定、生物學(xué)特性和室內(nèi)藥劑篩選，以期為田間油梨根腐病的發(fā)生、流行和防控提供參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?病株采集 ?2018年9月，3 a樹齡油梨病株采自海南省白沙黎族自治縣大嶺農(nóng)場附近的某種植基地。

1.1.2 ?試驗試劑 ?DNA快速抽提試劑盒（OMEGA BIO-TEK）、DNA片段回收試劑盒、Taq酶、DNA Marker和通用引物（表1）。參照《植病研究方法》[26]和《植物病理學(xué)實驗技術(shù)》[27]制備試驗所需培養(yǎng)基。供試藥品名稱及經(jīng)初篩后確定的復(fù)篩濃度見表2。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌株的分離及純化 ?采用組織分離法[26]對菌株進行分離。具體方法如下：選取具有典型癥狀的發(fā)病側(cè)根，用自來水清洗干凈，晾干，在超凈工作臺取5 mm發(fā)病側(cè)根，先用75%酒精消毒30 s，2%次氯酸鈉消毒3 min，再用無菌水清洗3次（每次30 s），置于10% V8培養(yǎng)基上，28 ℃連續(xù)光照培養(yǎng)，待病根組織塊長出少量菌絲時，挑取菌落邊緣菌絲至新鮮的10% V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用無菌接種針挑取菌絲尖端純化菌株，并將純化的菌株轉(zhuǎn)接于10% V8斜面培養(yǎng)基，于25 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?菌株的致病性測定 ?試驗材料為滅菌基質(zhì)上培育的健康油梨幼苗，采用無傷和刺傷2種方式進行致病性測定。將菌株置于28 ℃連續(xù)光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，用直徑5 mm的無菌打孔器取菌餅，然后將菌餅緊貼在油梨苗根部，對照組用無菌培養(yǎng)基，表面覆蓋無菌吸水紙保濕，每個處理10株，重復(fù)3次，觀察和記錄發(fā)病情況。待出現(xiàn)癥狀后，取發(fā)病根部再分離病原菌，觀察菌落特征和孢子囊形狀。

1.2.3 ?病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 ?28 ℃，連續(xù)光照條件下，用10% V8培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌6 d后，從菌落上挑取菌絲體至10% V8培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，再從培養(yǎng)液中挑取菌絲體至土壤浸出液中培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量球形厚垣孢子和孢子囊。

1.2.4 ?病原菌的分子生物學(xué)鑒定 ?用無菌藥匙刮取新鮮氣生菌絲100 mg，用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（OMEGA BIO-TEK）提取基因組DNA。PCR擴增所用的通用引物見表1。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物并純化后，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成序列測定。測序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對后，提交序列至GenBank。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載已報道的其他相關(guān)基因序列，用拼接軟件SequenceMatrix按照ITS-LSU-COXⅡ順序串聯(lián)，用MEGA 7.0軟件的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 ?生物學(xué)特性測定 ?（1）培養(yǎng)基對菌絲生長的影響。28 ℃，黑暗條件下，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)病原菌6 d，用直徑5 mm滅菌打孔器取菌餅，然后分別轉(zhuǎn)接至PDA、馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、番茄瓊脂培養(yǎng)基（TA）、10% V8培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）、大豆瓊脂培養(yǎng)基（SA）和胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA），培養(yǎng)4 d，每個處理重復(fù)4次，用十字交叉法測量菌落直徑。

（2）溫度對菌絲生長的影響。設(shè)置8個溫度梯度，分別為15、20、25、28、30、32、35、40 ℃，然后將菌餅轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d，每個處理重復(fù)4次。培養(yǎng)條件、菌餅制備和菌落直徑測量方法同1.2.5-（1）。

（3）pH對菌絲生長的影響。高壓蒸汽滅菌后，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH，pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，轉(zhuǎn)接菌餅至PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d，每個處理重復(fù)4次。培養(yǎng)條件、菌餅制備和菌落直徑測量方法同1.2.5-（1）。

（4）光照對菌絲生長的影響。將3個培養(yǎng)箱分別設(shè)置24 h光照、12 h光暗交替和24 h黑暗，轉(zhuǎn)接菌餅至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，每個處理重復(fù)4次。培養(yǎng)條件、菌餅制備和菌落直徑測量方法同1.2.5-（1）。

1.2.6 ?室內(nèi)藥劑篩選 ?采用菌絲生長速率法[28]測定藥劑對菌絲生長的影響。各藥劑按表2的濃度配制成溶液，加入到冷卻至室溫的PDA培養(yǎng)基混勻，倒平板，以不添加藥劑的PDA培養(yǎng)基作為空白對照，按照1.2.5-（1）制備菌餅，并將菌餅轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，每個處理重復(fù)4次，用十字交叉法測量菌落直徑。計算各藥劑對菌絲生長的相對抑制率，以各藥劑濃度的對數(shù)值作為自變量x，以菌絲抑制百分率的幾率值作為因變量y，計算藥效回歸方程和相關(guān)系數(shù)R和抑制有效中濃度（EC50），EC50反映藥劑對病原菌抑制作用的強弱[28]。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件和Graphpad Prism 8軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?田間癥狀描述

2018年9月，在海南省白沙黎族自治縣大嶺農(nóng)場的某油梨種植基地發(fā)現(xiàn)3 a樹齡油梨葉片大量干枯脫落，導(dǎo)致油梨植株死亡。地上部分癥狀：初期葉片由綠色變?yōu)闇\黃色至黃色，繼而發(fā)病植株葉片大量脫落，樹冠稀疏，后期發(fā)病植株葉片全部干枯并大量脫落（圖1A，圖1B，圖1C）。地下根部癥狀：從根尖開始發(fā)病，發(fā)病初期根尖變?yōu)闇\褐色至黑色，極易斷，并由根尖逐漸向側(cè)根、主根和莖基部擴展，導(dǎo)致根部和莖基部逐漸也變?yōu)楹谏S著病害進一步擴展，病根腐爛，剖開莖基部皮層可見疏松皮層（圖1D，圖1E）。

2.2 ?菌株致病力測定

接種15 d后，有傷和無傷接種部位的側(cè)根均可見明顯癥狀，由白色變?yōu)闇\褐色，地上部分也出現(xiàn)明顯的變化，葉片下垂，出現(xiàn)萎蔫（圖2A，圖2B，圖2D，圖2E）;接種30 d后，周圍健康的側(cè)根也表現(xiàn)出明顯的癥狀，發(fā)病率為100%，而對照組全健康（圖2C，圖2F）。從接種根部的發(fā)病部位分離到與接種菌株菌落生長性狀和孢子囊形態(tài)相同的病原菌。

2.3 ?病原菌形態(tài)觀察

病原菌在10% V8培養(yǎng)基上生長速度較快，氣生菌絲不發(fā)達，菌絲無色透明、無隔膜、粗細均勻，或產(chǎn)生特有的珊瑚狀菌絲（圖3A，圖3B，圖3C）。厚垣孢子球形，簇生或頂生，直徑為34.1～53.7 μm（平均42.5 μm）（圖3D，圖3E）;孢子囊著生在孢囊梗頂部，橢圓形或卵圓形，頂端無乳突，長為44.7～60.6 μm（平均50.0 μm），寬為28.0～38.1 μm（平均32.1 μm）（圖3F，圖3G）。根據(jù)上述形態(tài)學(xué)特征，與鄭小波[29]的報道結(jié)果相近，可初步判斷引起該病害的病原菌為樟疫霉（P. cinnamomi Rands）。

2.4 ?病原菌分子生物學(xué)鑒定

將克隆和測序得到的病原菌YLPC0321的ITS、LSU和COXⅡ序列提交至GenBank，登錄號分別為MT229356、MT240478和MT233527。將3個基因序列在NCBI上進行BLAST比對，并與NCBI下載的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：病原菌YLPC0321與P. cinnamomi在自舉值為100%水平上聚在同一個進化分支（圖4）。根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)分析，最終將油梨根腐病病原菌鑒定為樟疫霉（P. cinnamomi Rands）。

2.5 ?生物學(xué)特性測定

2.5.1 ?培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 ?在供試的8種培養(yǎng)基上病原菌YLPC0321的菌絲生長速率存在顯著差異（圖5）。SA培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快，培養(yǎng)4 d菌落直徑達7.5 cm，氣生菌絲不發(fā)達;而在PDA培養(yǎng)基上的菌落氣生菌絲發(fā)達，呈花瓣狀，邊緣不整齊，菌絲生長速度較快;在PCA、10% V8、TA、OMA、CA、CMA培養(yǎng)基上的菌落平展，不呈花瓣狀，邊緣較為整齊，氣生菌絲較發(fā)達或極不發(fā)達。

2.5.2 ?溫度對菌絲生長的影響 ?病原菌YLPC 0321在15～30 ℃間均能生長。在15～28 ℃間，不同處理溫度之間存在顯著差異，菌絲生長速度不斷增加，當溫度達到28 ℃時，菌絲生長速度最快，菌落直徑達7.52 cm;在28～30 ℃時，菌絲生長速度隨溫度的增加開始緩慢下降，在32～35 ℃時，菌絲生長速度急劇下降，當溫度達到40 ℃時，菌絲停止生長。由此可說明該病原菌的最適生長溫度為28 ℃（圖6）。

2.5.3 ?pH對菌絲生長的影響 ?病原菌YLPC0321在pH 3～10時均能生長。pH為3～8時，不同pH之間存在顯著差異，菌絲生長速率隨pH的增加而顯著增加。pH為8時，菌落直徑最大，為6.68 cm;pH為8～10時，不同pH之間存在顯著差異，菌絲生長速率隨pH的增加呈明顯的負增長;pH為11時，菌絲停止生長（圖7）。說明該病原菌更適合生長在微堿性環(huán)境中，過酸或過堿均不適合該病原菌的生長。

2.5.4 ?光照對菌絲生長的影響 ?不同光照條件對病原菌菌絲生長具有顯著影響。黑暗條件下，菌絲生長速度最快，直徑達7.85 cm;光暗交替條件下，菌絲生長速度較快，直徑達6.87 cm;光照條件下，菌絲生長速度最慢，直徑為6.39 cm（圖8）。由此可知，該病原菌更適合生長在黑暗條件下。

2.6 ?室內(nèi)藥劑篩選

結(jié)果顯示，10種藥劑對油梨根腐病病原菌生長的抑制效果不同。烯酰嗎啉的抑制作用最強，EC50為0.0929 ?g/mL，氟嗎·精甲霜和烯酰·錳鋅的EC50均小于1 ?g/mL，其中，氟嗎·精甲霜的EC50為0.4146 ?g/mL，丙森· 嘧菌酯、精甲霜·錳鋅、錳鋅·氟嗎啉、噁霜·錳鋅和霜脲·錳鋅的抑制效果相對較弱，而精甲·咯菌腈和敵磺鈉對病原菌的抑制作用最差，EC50分別為12.4525 ?g/mL（表3）和39.9554 ?g/mL。因此，烯酰嗎啉可以作為進一步進行田間防治效果試驗。

3 ?討論

樟疫霉（P. cinnamomi）屬腐霉科（Pythiaceae）疫霉屬（Phytophthora），分布地區(qū)和寄主范圍十分廣泛，目前，它主要分布在亞洲、非洲、北美洲、南美洲、中美洲和大洋洲等地區(qū)，可侵染鳳梨、木瓜、香樟、蘭嶼肉桂、雪松、山茶和油梨等，其寄主多達3000種，造成農(nóng)作物巨大的經(jīng)濟損失。1922年，Rands從印尼的蘇門答臘島地區(qū)發(fā)病的肉桂樹上首次發(fā)現(xiàn)樟疫霉（P. cinnamomi）[4， 29-33]。1942年，在美國加州首次鑒定樟疫霉是引起油梨根腐病的病原菌[4]。該病害首先從根尖或根部傷口侵入，繼而逐漸向側(cè)根、主根和莖基部擴展，最終導(dǎo)致植株死亡。在國內(nèi)，關(guān)于樟疫霉引起的油梨根腐病的報道主要是綜述性文獻[34]。本研究中，筆者通過對病害田間癥狀診斷及描述、病原菌分離及純化、致病性測定、病原菌形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)分析，將為害油梨根部病害的病原菌鑒定為樟疫霉（P. cinnamomi），屬國內(nèi)首次結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定油梨根腐病的病原。

本文較系統(tǒng)地研究了油梨根腐病菌的生物學(xué)特性。在供試的8種培養(yǎng)基中，病原菌均可生長，但病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈花瓣狀，且菌絲最為濃密，較適合病原菌的生長。徐敬友等[35]報道了從雪松上分離的樟疫霉菌在OMA培養(yǎng)基上氣生菌絲生長旺盛，而本研究中，樟疫霉菌在OMA培養(yǎng)基上氣生菌絲不旺盛，不適合該病原菌的生長;該病原菌對溫度的適應(yīng)范圍相對較廣，在15～35 ℃均能生長，在25～30 ℃生長良好，最適生長溫度為28 ℃。王明生等[32]報道樟疫霉生長的最適溫度范圍為26～29 ℃，與本研究的結(jié)論基本相同;該病原菌更適合生長在微堿性的環(huán)境中，最適生長的pH為8，與鄭小波[29]的報道一致，而謝光煜等[25]報道，土壤pH為6.5時，最利于該病害發(fā)生;黑暗條件更有利于該病原菌的生長。

目前，F(xiàn)ungicide Resistance Action Committee（FRAC）報道了可用于防治由樟疫霉引起的油梨根腐病的殺菌劑有精甲霜靈和亞磷酸。精甲霜靈可用于防治由疫霉屬和其他卵菌綱引起的病害[36]，可以干擾病原菌RNA聚合酶并阻斷病原菌RNA的合成[37]，可有效抑制菌絲體生長和產(chǎn)孢，但其缺點是對病原菌作用位點單一，易產(chǎn)生抗藥性[38]。亞磷酸可以直接抑制病原菌生長，但其具體作用方式尚不清楚[39-40]，據(jù)報道可能與宿主植物防御系統(tǒng)的誘導(dǎo)有關(guān)[41-42]。本研究在室內(nèi)條件下測定了10種藥劑對油梨樟疫霉菌生長的抑制效果，結(jié)果表明烯酰嗎啉的抑制效果最好，EC50為0.0929 ?g/mL，后續(xù)可以進行田間防治效果試驗，并對其作用方式進行研究。

在油梨種植過程中，應(yīng)采取“預(yù)防為主、綜合防治”的方針防控油梨根腐病的發(fā)生。樟疫霉是一種土傳病害[24]，在潮濕、偏堿的環(huán)境有利于病害的發(fā)生，高溫、干旱和偏酸的環(huán)境對病害的發(fā)生不利。在種植油梨前，應(yīng)深翻暴曬土壤減少菌源侵染，適當增施有機肥，以豐富土壤的微生態(tài)環(huán)境，施用酸性肥料降低土壤pH，營造不利于病原菌生長的環(huán)境，可以有效控制病害的發(fā)生;選擇肥力高，土層較厚的沙土為宜，這種地塊土壤通透性好，雨后有利于及時排出積水;選用健壯種苗，深溝高畦栽培，可及時排水，降低田間濕度;田間植株得病后，可采取化學(xué)藥劑防治。本研究結(jié)果表明，烯酰嗎啉對菌絲生長的抑制效果最好，可進一步進行田間防治試驗;病株死亡后，提倡原位處理，不建議清除病株，因為在清除病株時，病原菌所處的微生態(tài)環(huán)境遭到破壞，可能會向周圍蔓延，從而侵染其他健康的植株，造成根腐病發(fā)生更加嚴重。油梨根腐病在全世界所有種植區(qū)都有發(fā)生，是制約油梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一，本研究為今后油梨病害的田間防控提供了一定的理論依據(jù)。

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