磺胺類抗生素對(duì)根際微域土壤酶活性的影響

李亞寧，盛紅坤,王斌，吳鵬，高相艷，劉培翔

(1.南開(kāi)大學(xué)濱海學(xué)院 環(huán)境科學(xué)與工程系，天津 300270；2.南開(kāi)大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，天津 300071；3.天津市北大港濕地自然保護(hù)區(qū)管理中心，天津 300270)

禽畜養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的抗生素濫用，導(dǎo)致抗生素隨動(dòng)物糞肥進(jìn)入農(nóng)田土壤環(huán)境，并在土壤中積累[1-3]。其中磺胺類抗生素(SAs)在農(nóng)田土壤中檢出率較高，同時(shí)也是含量較高的[4-5]。植物根際是植物根系、土壤、微生物緊密結(jié)合的獨(dú)特微環(huán)境區(qū)域[6-9]。由于植物根系的作用，其性質(zhì)與遠(yuǎn)離根際區(qū)域的土壤差異顯著，尤其是當(dāng)污染物脅迫的情況下，根系分泌物中的碳源和能源顯著增加，微生物量和活性亦顯著增強(qiáng)，進(jìn)而影響根際微域土壤酶的活性[10-14]。

土壤酶是土壤的活躍有機(jī)組分，在土壤環(huán)境中起到重要的催化作用，其活性高低可表征污染物降解能力及土壤環(huán)境質(zhì)量等[15-17]。因此，本文選用土壤脫氫酶(DHA)和過(guò)氧化氫酶(CAT)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)多隔層根際箱實(shí)驗(yàn)研究磺胺甲惡唑(SMZ)和磺胺甲基嘧啶(SM1)在植物根際微環(huán)境中對(duì)土壤酶活性的作用。以期為土壤環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)及對(duì)人類可能產(chǎn)生的暴露風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)指導(dǎo)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

磺胺甲惡唑、磺胺甲基嘧啶均為優(yōu)級(jí)純，純度均為98%;供試土壤,采自天津植物園未污染地塊(取0～20 cm表層土壤);供試植物為油菜(Brassicacampestris)，種子由天津黃瓜研究所提供。

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);Hettich 32R低溫高速冷凍離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用多隔層根際箱法[18]，每個(gè)根際箱長(zhǎng)20 cm，寬20 cm，高10 cm。根際箱共有11個(gè)分區(qū)，分別為中心區(qū)(R)，左、右近根1區(qū)(NR1)，左、右近根2區(qū)(NR2)，左、右近主體土壤1區(qū)(NB1)，左、右近主體土壤2區(qū)(NB2)，左、右主體土壤區(qū)(B)，每個(gè)分區(qū)間以尼龍網(wǎng)相隔。尼龍網(wǎng)可避免中心區(qū)根組織生長(zhǎng)時(shí)透過(guò)進(jìn)入相鄰區(qū)域，但可確保根系分泌物、微生物、水分、營(yíng)養(yǎng)等的遷移。供試土壤風(fēng)干后，過(guò)篩(2 mm)。將SMZ或SM1與土壤充分混勻，使最終染毒濃度為15.0,45.0 mg/kg。每個(gè)根際箱加入土壤2.5 kg。

油菜種子于25 ℃下催芽培養(yǎng)后，挑選大小均一的幼苗移入不同染毒組的根際箱中進(jìn)行培養(yǎng)，共設(shè)置4個(gè)處理組，每個(gè)處理組重復(fù)2次。第1、2個(gè)處理組為低濃度抗生素染毒組，分別為15.0 mg/kg SMZ與SM1；第3、4個(gè)處理組為高濃度抗生素染毒組，分別為45.0 mg/kg SMZ與SM1。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。培養(yǎng)2個(gè)月后，開(kāi)箱，取出各層隔板，并將左、右對(duì)應(yīng)的同一分區(qū)土壤樣品混勻，測(cè)定各區(qū)的土壤DHA與CAT活性。

1.3 土壤酶活性測(cè)定

土壤DHA活性的測(cè)定采用2,3,5-三苯基四唑氯化物顯色法(TTC法)[19]；土壤CAT活性的測(cè)定采用硫酸鈦比色法[19]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)采用Origin 8.5進(jìn)行繪圖，并用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著差異水平P取0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 SAs對(duì)油菜根際微域土壤DHA活性的影響

2.1.1 SMZ對(duì)油菜根際微域土壤DHA活性的影響 SMZ脅迫下，油菜根際微域土壤DHA活性變化見(jiàn)圖1。

圖1 SMZ對(duì)油菜根際微域土壤DHA活性的影響Fig.1 Effects of SMZ on the activity of DHA in rape planted rhizosphere soil**P<0.01或*P<0.05為處理組與對(duì)照組進(jìn)行比較

由圖1可知，低濃度與高濃度SMZ處理組中，油菜根際DHA活性的變化趨勢(shì)基本一致，首先近根2區(qū)NR2的DHA活性最高，其次為近根1區(qū)NR1，再次為中心區(qū)R，然后是近主體土壤1區(qū)NB1和2區(qū)NB2，最后是主體土壤區(qū)B。同時(shí)，對(duì)R和NR1區(qū)而言，低濃度處理組促進(jìn)了DHA的活性，高濃度處理組抑制了DHA的活性。對(duì)NB1、NB2和B區(qū)而言，無(wú)論低濃度還是高濃度處理組，均對(duì)DHA的活性起到了抑制作用。而無(wú)論低濃度還是高濃度SMZ脅迫，均顯著(P<0.05)誘導(dǎo)了NR2區(qū)的DHA活性。除NR2區(qū)外，45 mg/kg SMZ脅迫下，各分區(qū)土壤的DHA活性均顯著(P<0.05)低于15 mg/kg SMZ處理組，表明隨著染毒濃度增加，DHA活性降低。

2.1.2 SMI對(duì)油菜根際微域土壤DHA活性的影響 圖2顯示了SM1脅迫對(duì)油菜根際微域土壤DHA活性的影響。

由圖2可知，首先無(wú)論低濃度還是高濃度SM1處理組，均為NR2的DHA活性最高，NR1區(qū)次之，再者是R區(qū)，然后分別是NB1、NB2和B區(qū)。同時(shí)對(duì)NR1和NR2區(qū)而言，無(wú)論低濃度還是高濃度SM1脅迫，均誘導(dǎo)了DHA的活性，而對(duì)R區(qū)而言，低濃度處理組極顯著(P<0.001)抑制了DHA的活性，而高濃度處理組DHA活性與對(duì)照相較，無(wú)顯著(P>0.05)差異。對(duì)NB1、NB2和B區(qū)而言，低濃度處理組對(duì)DHA的活性起到極顯著(P<0.01)抑制作用，高濃度處理組則對(duì)DHA的活性起到顯著(P<0.05)抑制作用。除NR1與NR2區(qū)外，45 mg/kg SM1脅迫下，各分區(qū)土壤的DHA活性均顯著(P<0.05)高于15 mg/kg SM1處理組，表明隨著染毒濃度增加，DHA活性升高。

圖2 SM1對(duì)油菜根際微域土壤DHA活性的影響Fig.2 Effects of SM1 on the activity of DHA in rape planted rhizosphere soil**P<0.01或*P<0.05為處理組與對(duì)照組進(jìn)行比較

2.2 SAs對(duì)油菜根際微域土壤CAT活性的影響

2.2.1 SMZ對(duì)油菜根際微域土壤CAT活性的影響 SMZ脅迫下，油菜根際微域土壤CAT活性變化見(jiàn)圖3。

圖3 SMZ對(duì)油菜根際微域土壤CAT活性的影響Fig.3 Effects of SMZ on the activity of CAT in rape planted rhizosphere soil**P<0.01或*P<0.05為處理組與對(duì)照組進(jìn)行比較

由圖3可知，無(wú)論低濃度還是高濃度SMZ處理組，均為NR2的CAT活性最高，NR1區(qū)次之，再者是R區(qū)，接下來(lái)分別是NB1、NB2和B區(qū)。同時(shí)，對(duì)R、 NR1和NR2區(qū)而言，無(wú)論低濃度還是高濃度處理組，均促進(jìn)了CAT的活性，而對(duì)NB1而言，為低濃度處理組促進(jìn)了CAT的活性，高濃度處理組抑制了CAT的活性。對(duì)NB2和B區(qū)而言，無(wú)論低濃度還是高濃度處理組，均對(duì)CAT的活性起到了抑制作用。同時(shí)，隨染毒濃度增加，各區(qū)CAT活性均顯著(P<0.05)降低。

2.2.2 SM1對(duì)油菜根際微域土壤CAT活性的影響 圖4為SM1脅迫下，油菜根際微域土壤CAT活性的變化。

圖4 SM1對(duì)油菜根際微域土壤CAT活性的影響Fig.4 Effects of SM1 on the activity of CAT in rape planted rhizosphere soil**P<0.01或*P<0.05為處理組與對(duì)照組進(jìn)行比較

由圖4可知，無(wú)論低濃度還是高濃度SM1處理組，油菜根際CAT的活性均為NR2區(qū)最高，接下來(lái)依次是NR1區(qū)、R區(qū)、NB1、NB2和B區(qū)。同時(shí)，無(wú)論低濃度還是高濃度SM1處理組，幾乎都對(duì)各區(qū)的CAT活性起到了誘導(dǎo)作用，在NR2、NR1和R區(qū)，更是起到了極顯著(P<0.01)誘導(dǎo)作用。并且，隨染毒濃度增加，各區(qū)CAT活性均顯著(P<0.05)降低。

2.3 SAs污染對(duì)油菜根際微域土壤DHA及CAT活性影響的總體分析

不同種類酶對(duì)不同種類磺胺類抗生素的響應(yīng)不同，但整體上土壤酶活性均為在左、右近根2區(qū)，即NR2區(qū)的響應(yīng)值最高，其次為左、右近根1區(qū)即NR1，再次為中心區(qū)即R區(qū)，然后再隨著與植物根際距離的加大，土壤酶活性逐漸降低，依次為左、右近主體土壤1區(qū)(NB1)，左、右近主體土壤2區(qū)(NB2)和左、右主體土壤區(qū)(B)。在以前的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果，在重金屬污染物Cd的污染作用下，大豆近根際區(qū)域的土壤酶活性要高于中央?yún)^(qū)域和遠(yuǎn)根際區(qū)域[14]。在研究土霉素在小麥根際的微生態(tài)效應(yīng)時(shí)，也發(fā)現(xiàn)小麥煙農(nóng)21和核優(yōu)1號(hào)根際區(qū)域的過(guò)氧化氫酶等土壤酶活性高于遠(yuǎn)離根際的區(qū)域[20]。在植物根際環(huán)境中，植物根系及各種微生物會(huì)不斷向土壤中釋放各種酶，即所謂的土壤酶，從而通過(guò)其作用將根際中的污染物進(jìn)行分解代謝，近根際區(qū)域的土壤酶活性較高，說(shuō)明在某種層面上此區(qū)域較適合于污染物的降解[21-22]。同時(shí)，土壤酶活性的變化可以在一定程度上反應(yīng)土壤受污染的程度。李明珠等在進(jìn)行銅脅迫下磺胺嘧啶對(duì)土壤呼吸及酶活性影響的分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)土壤脫氫酶對(duì)SDZ單一及其與Cu復(fù)合污染都較為敏感，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)期內(nèi)，各污染處理中其活性均受到了顯著的抑制[23]。這與本研究結(jié)果相似，在磺胺甲惡唑與磺胺甲基嘧啶脅迫下，除近根際區(qū)域外，其余區(qū)域的土壤脫氫酶活性均被抑制，且距離根區(qū)越遠(yuǎn)，抑制程度越顯著。在進(jìn)行的一項(xiàng)關(guān)于土壤CO2濃度對(duì)土壤酶活性影響的研究中發(fā)現(xiàn)隨CO2濃度升高，玉米、豌豆和黑麥草根際土壤脫氫酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)[24]。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，隨著抗生素染毒劑量的增加，脫氫酶活性降低，尤其是遠(yuǎn)根際區(qū)域，脫氫酶活性逐漸轉(zhuǎn)為抑制。脫氫酶活性降低說(shuō)明細(xì)菌生物量等微生物活性下降，高濃度的抗生素對(duì)微生物活性產(chǎn)生了抑制作用。同時(shí)，在本研究中磺胺類抗生素對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性呈現(xiàn)較為明顯的誘導(dǎo)作用，這可能是由于抗生素染毒濃度尚在植物可調(diào)節(jié)的閾值范圍內(nèi)，酶活性的誘導(dǎo)會(huì)使生物呼吸過(guò)程中的過(guò)氧化氫分解及物質(zhì)代謝等過(guò)程受到促進(jìn)，進(jìn)而使得土壤的代謝能力和對(duì)有機(jī)物的分解能力大大增強(qiáng)，是植物體保護(hù)自身的一種機(jī)制。

3 結(jié)論

(1)SMZ脅迫下，低濃度處理組促進(jìn)了根際及近根際區(qū)的DHA活性，而高濃度處理組則抑制了R和NR1的DHA活性。同時(shí)，各濃度處理組均抑制了主體土壤區(qū)及近主體土壤區(qū)中DHA的活性。同時(shí)，隨著染毒濃度增加，DHA活性降低。

(2)SM1脅迫下，各濃度處理組均誘導(dǎo)了近根際區(qū)的DHA活性，卻抑制了R區(qū)的DHA活性。在主體土壤區(qū)及近主體土壤區(qū)中，各濃度處理組均對(duì)DHA的活性起到抑制作用。同時(shí)，隨著染毒濃度增加，DHA活性升高。

(3)SMZ脅迫下，各濃度處理組均誘導(dǎo)了根際及近根際區(qū)的CAT活性。低濃度處理組誘導(dǎo)了NB1的CAT的活性，而高濃度抑制了該區(qū)的CAT活性。在NB2和B區(qū)中，各濃度處理組均對(duì)CAT的活性起到了抑制作用。同時(shí)，隨染毒濃度增加，各區(qū)CAT活性均顯著(P<0.05)降低。

(4)SM1脅迫下，各濃度處理組幾乎均對(duì)各微域分區(qū)的CAT活性起到了誘導(dǎo)作用，在根際及近根際區(qū)更是起到了極顯著誘導(dǎo)作用。并且，隨染毒濃度增加，各區(qū)CAT活性均顯著降低。

(5)兩種土壤酶對(duì)兩種磺胺類抗生素的響應(yīng)雖不同，但整體上土壤酶活性均為NR2區(qū) > NR1區(qū) > R區(qū) > NB1區(qū) > NB2區(qū) > B區(qū)，并不是簡(jiǎn)單的隨距離增加呈遞減趨勢(shì)。