第十屆中國花博會中煙草脆裂病毒生物學特性及檢測監控技術應用

田沂民 朱雅君 印麗萍 陳仲兵 滕 凱 于 翠

第十屆中國花博會于2021年5月21日-7月2日在上海崇明島舉辦。其中從國內外大規模輸入新品種植物種球、種苗、種子、種植介質及木質包裝品。這些植物及其相關產品很可能會攜帶大量外來生物，使得崇明島的生態安全遭受重大威脅。病毒是迄今為止人們在超微世界里所認知的最小生物之一，其隨植物傳播擴散更為隱秘，這嚴峻考驗著防控能力。其中煙草脆裂病毒是一種能侵染多種花卉植物的植物病毒，通過寄主植物繁殖材料（種球、砧木、芽條等）的貿易活動進行遠距離病毒傳播，或借助帶毒介體線蟲進行短距離擴散，為阿根廷、巴西、加拿大、墨西哥、土耳其等國家的檢疫性有害生物，在我國局部地區有發生。本次花博會大面積布置的百合、芍藥、玉簪等都是其主要寄主，一旦傳入可引起嚴重生態影響和經濟損失。研究從煙草脆裂病毒的寄主范圍、危害癥狀、傳播擴散途徑等生物學特性及經濟影響、檢測監控技術應用等方面進行闡述，為防止其再次入侵和進一步傳播擴散提供參考，為花博會生態安全提供技術保障。

第十屆中國花博會；煙草脆裂病毒；生物學特性；檢測監控技術

煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）為桿狀病毒科（Virgaviridae）煙草脆裂病毒屬（Tobraviruses）典型成員，可在花卉、蔬菜等經濟作物上引起嚴重經濟損失。TRV是阿根廷、巴西、加拿大、墨西哥、土耳其等國家的檢疫性有害生物。該病毒寄主范圍十分廣泛，可侵染超過50個科400種植物，在歐洲、北美、新西蘭、俄羅斯、日本40多個國家已經發生和報道，在我國福建、河北、江蘇、云南等地的牡丹、水仙、菠菜、辣椒、馬鈴薯等作物上有發生報道[1-6]。

中國花博會是我國花卉領域規格最高、影響最廣的綜合性花事盛會，被譽為中國花卉界的“奧林匹克”。第十屆中國花博會于2021年5月21日-7月2日在上海崇明舉辦。本屆花博會選址東平國家森林公園及周邊地區，園區總面積10 km2，規劃布局“一軸、一帶、三區”（主題演繹軸、十里花溪帶、核心展示區、森林景觀區和配套服務區），充分展示我國花卉領域的最新成果和花卉產業的高質量發展?；I辦花博會是上海貫徹落實習近平同志“綠水青山就是金山銀山”“建設美麗中國”等富有生態智慧的重要論斷的行動體現，對促進崇明“世界級生態島”建設、凝聚綠色發展產業的核心競爭力具有十分重要的推動作用，并為上海在貫徹落實“長三角一體化”國家戰略過程中，打造具有區域特色的綠色發展體系、促進生態建設與保護能級提升起到重要的引領性示范作用。

植物的引種布展和園區的生態景觀營建是本屆花博會各項工作中的中心任務，在這一任務的落實過程中，生態風險防范亟需高度重視。國內外重大會展或活動類盛會的經驗和教訓得出，生物風險歷來是這些活動中最重要的生態風險源，特別是由人類活動及植物引種與調運導致的有害動植物的傳播與危害，可以形成嚴重的生態后果，其對區域生態系統健康和相關產業發展帶來的負面影響甚至是不可逆轉的。例如，2004年雅典奧運會的舉辦，導致棕櫚科大害蟲紅棕象甲入侵，其在東地中海地區對當地綠化景觀構成了極其嚴重的破壞，造成的生態影響至今仍未消除[7-8]。

崇明花博會的生物災害風險主要來自以下幾個方面：頻繁的植物調運和高密度人流使潛在危險性有害生物導入風險極大。參展植物逃逸導致外來植物入侵的可能性增加是本屆花博會面臨的另一重大生態風險。2021年在崇明舉辦的第十屆中國花博會，從島外大規模輸入活體植物、木質包裝品及種植介質，使得崇明島的生態安全遭受重大威脅，其面臨的生態風險遠超2010年上海世博會。經過前期的風險分析，認為TRV隨種苗調運傳入崇明島的風險較高，因此將其列為本次花博會重點防控的有害生物。作為一種寄主范圍廣泛的病毒，TRV不僅毒力強、株系多，而且存在巨大的危害和潛在風險。對這些風險進行提前預判，構建有效的防控體系，是科學化解相關風險的有效途徑。文章擬從TRV的生物學特性、診斷檢測及監控技術等方面進行闡述，為防范TRV隨種苗再次傳入及傳播擴散提供參考。

1 病毒特性

TRV是侵染性較強的病毒，其病毒粒子為剛直桿狀，無包膜，直徑20～23 nm，病毒為二分體病毒，有兩種典型長度，180～215 nm的粒子包含RNA1，而46～1 15 nm的粒子包含RNA2，侵染時必須包含兩種粒子。TRV體外稀釋限點為10-5～10-6。室溫下病毒粒子在粗提液中保持侵染性超過2個月，而在冷凍狀態下，其侵染性可保持長達1年。體外致死溫度80℃～85℃[9]。根據病原特性、血清學關系、指示植物癥狀及線蟲介體的不同，TRV劃分為多個株系[10-11]。按照血清學關系，可分為PRN、ASH、SYM和Jeff 4組，其中PRN血清型是分布最廣經濟價值最重要的株系[12]。

2 生物學特性

2.1 寄主植物和癥狀

TRV寄主范圍很廣，超過50個科400種雙子葉和單子葉植物易受侵染。自然條件下能侵染郁金香（Tulipa gesneriana）、風信子（Hyacinthus orientalis）、水仙（Narcissus tazetta）、一串紅（Salvia splendens）、旱金蓮（Tropaeolum majus.）、矮牽牛（Petunia hybrida）、過路黃（Lysimachia nummularia）、八仙花（Hydrangea macrophylla）、杓蘭（Cypripedium reginae）、透骨草（Phryma leptostachya）、菠菜（Spinacia oleracea）、番紅花（Crocus sativus）、小蒼蘭（freesia hybrida）、芫荽（Coriandrum sativum）、向日葵（Helianthus annuus）、蘿卜（Raphanus sativus）、 豌 豆（Pisum sativum）、 菠 菜（Spinacia oleracea）、 羅 勒（Ocimum basilicum）、大豆（Glycine max）、甜菜（Beta vulgaris）、馬鈴薯（Solanum tuberosum），以及芍藥屬（Paeonia）、景天屬（Sedum）、茄屬（Solanum）等花卉、蔬菜及其他經濟作物，此外部分莧屬（Amaranthus）、蒿屬（Artemisia）、車前草屬（Plantago）等野生雜草也是其寄主。侵染甜菜、菠菜等會引起褪綠、局部壞色斑和系統斑駁；侵染馬鈴薯等產生局部壞死斑或壞死條紋；侵染煙草等引起局部壞死或褪綠環斑，系統壞死、條紋或斑駁；侵染玉簪和百合等則產生斑駁癥狀（圖1）。但有時因為株系不同，寄主不表現明顯的癥狀。當前，TRV診斷的鑒別寄主為莧色藜、黃瓜、煙草和菜豆。

1. TRV侵染部分寄主癥狀（源自網絡）

2.2 傳播途徑

TRV不能通過地上部分的昆蟲介體或農事操作進行傳播。在育苗田或農田中主要是通過毛刺線蟲屬（Trichodorus）和擬毛刺線蟲屬（Paratrichodorus）的線蟲進行傳播，已知共有14種線蟲可傳播該病毒。T. primitivus、T. similis和P. pachydermus是最廣泛的傳播介體[13-14]。有試驗表明，病毒株系與介體種類之間存在一定的轉化性。成蟲和若蟲可以傳毒，但是介體蛻皮后則不再持毒。線蟲通過取食系統感染的植物的根部1 h獲毒，并在1 h之內保留傳毒能力，但有些線蟲可保持傳毒能力達3個月。有人認為，病毒顆粒粘附到介體的食管壁上，當線蟲進食時連同唾液一起被分泌到根細胞。但是沒有病毒在介體內增殖的證據，因此，病毒不能通過線蟲的卵傳播。線蟲在10℃以上時，可傳播病毒，在15℃～20℃傳毒效率最高[15]。

TRV可在一些多年生雜草中越冬，成為次年病毒侵染的初侵染源。在野生堇菜（Viola arvensis）中傳毒的效率接近10%，在其他一些雜草中傳毒的效率更低[16]。另外至少有6種菟絲子可以傳播TRV。TRV雖可通過種子傳播，在甜菜種子中的種傳率可達5%～15%[17]，但種子傳播不是主要傳播方式。帶毒的鱗球莖花卉類種球如水仙、郁金香、百合、番紅花等是該病毒遠距離傳播的主要方式。

2.3 作為沉默載體應安全使用

在煙草（Nicotiana tabacum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、馬鈴薯等植物基因功能鑒定研究中，TRV常被用作誘導的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）載體。常見的RNA病毒載體有煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）、TRV等[18]。TRV作為誘導基因沉默的載體是目前應用最廣的載體之一，具有寄主范圍廣、沉默效率高、持續時間長等特點[19]。TRV為二分體RNA病毒，TRV載體是包括RNA2（pTRV2）和 RNA1（pBINTRA6）cDNA的雙元表達載體。尤其是在植物抗性基因的發掘方面，利用TRV成功在番茄中克隆到了一個NBS-LRR類抗病基因[20]。鑒于TRV在我國發生分布較少，一旦傳播擴散將對農林業生產構成威脅，作為病毒載體使用廣泛，各個實驗室應加強使用的安全管理，嚴防其泄露傳播。

3 經濟影響

在北美、歐洲、日本、新西蘭等地區，無論是嚴重發生業已本地化，還是尚沒有發生需要嚴加防范，TRV對很多國家蔬菜和花卉等的安全生產存在巨大風險。馬鈴薯塊莖是受TRV影響較大的作物，在生產過程中葉片出現斑駁癥狀，影響植物的光合作用，而且能直接侵染馬鈴薯塊莖導致軟腐癥狀，使其失去商品價值而導致嚴重的經濟損失[21]。美國西北部地區由煙草脆裂病毒引起的馬鈴薯軟腐病發生頻率為5%～10%，有時影響整個田地作物的銷售[22]。意大利南部地區因TRV和其他病毒混合侵染，導致萵苣產量有損失，而中部地區辣椒約30%～40%受TRV侵染，產量顯著減少[23]。在德國，TRV廣泛分布，侵染胡蘿卜導致產量損失10%～30%[24]。而花卉作物感染TRV雖沒有詳細的經濟損失報道，但一旦受到侵染，顯然會影響花卉的產量和品質。一旦因為花博會種苗的大量調運而使TRV傳播擴散，而目前對該病毒無有效防控措施，有可能對崇明島的生態環境和農作物生產造成不可逆轉的影響。

4 檢測鑒定方法

有多種方法可對TRV進行檢測和鑒定。生物學鑒定方法，即以摩擦法將TRV接種到指示植物或鑒別寄主黃瓜、煙草、莧色藜、菜豆上，當任意一種鑒別寄主出現褪綠、局部壞死斑或系統性的扭曲或壞死時，判定帶有TRV。然而，癥狀也同時受到環境條件和病毒株系的影響，一些病株產生癥狀或根本就不產生癥狀，接種后可通過血清或分子生物學方法進一步檢測鑒定。ELISA方法是一種快速、簡單易學且需實驗設備較少的一種方法，但是某些株系由于血清學關系較遠或病毒含量太低而被漏檢，目前在ELISA的基礎上還開發出靈敏度更高、特異性更好的Dot-ELISA、組織印記ELISA等多種方法。分子生物學技術方法的應用大大提高了TRV檢測的靈敏度、準確性和檢測效率。其中應用最普遍的為RT-PCR法和實時熒光RT-PCR法，使檢測靈敏度達到fg級，遠遠高于血清學方法，而且通過序列分析，還可確定病毒的株系[24]。此外，血清學和PCR技術相結合的免疫捕獲PCR方法，更進一步提高了檢測的特異性和靈敏度。為了適應口岸一線檢測要求，也發展建立了基因芯片檢測、多重RT-PCR檢測等方法[25-27]，通量高，檢測速度快。但首次檢出或某一地區首次發生時，應在分子檢測結果的基礎上，通過生物學或血清學方法再次進行驗證[28]。在本次花博會中，采用RT-PCR和Dot-ELISA等方法對進口的種球、宿根等樣品進行TRV檢測，結果從一批荷蘭進口的芍藥宿根中檢出該病毒。

5 監測防控技術

（1）檢疫措施。鑒于TRV可通過種苗傳帶，一方面要通過口岸檢疫來防止該病毒由貿易國家跨境傳入中國，為生產目的引進的種苗，要在海關總署指定進境口岸入境且根據引進目的在隔離檢疫圃隔離種植至少兩個生長季，觀察并檢測植株是否帶毒；另一方面要對云南等地的TRV進行監測，防止通過國內的花卉苗木調運進一步擴散。郁金香、風信子、水仙、芍藥、番紅花等種球是花博會從國外大量引種的花卉，也是TRV常感染的寄主。在進口通關的過程中應加強對該病毒的檢測，同時加強后續監測。

（2）改變種植方式。輪作非線蟲寄主植物或休耕是減少侵染源的主要方式，在種植馬鈴薯之后土地休耕控制TRV的傳播具有明顯的效果[29]。另外徹底清除寄主植物附近的雜草也是切斷初侵染源的主要措施之一。

（3）控制傳播媒介。線蟲是TRV的主要傳播媒介。通常有效的控制方法就是在認證體系下種植健康植株，定期施用殺線蟲劑防治線蟲，但線蟲常生活于地下1 m的土層中，藥劑熏蒸效果并不理想，因此常利用溴甲烷、威百畝、必速滅、二氯丙烯等熏蒸劑控制苗床線蟲種群數量[30]。

（4）選育培育抗病或耐病品種。借助常規育種或通過轉基因選擇育種，培育或選育抗病或耐病品種是控制TRV最有效的途徑[31-32]。通過不同類型或不同TRV抗性機制，已經培育或選育出抗TRV或耐TRV的馬鈴薯等新品種。

6 展望

TRV雖僅在我國局部區域分布，但其對蔬菜、花卉產業危害嚴重，潛在威脅巨大，加之TRV感染之后很難醫治，只能拔除銷毀，引起巨大經濟損失；另一方面，近年來國內從境外大量引進花卉種球、植株，TRV隨種植材料再次傳入中國并進一步傳播擴散的可能性極大，而TRV寄主范圍廣，國內隨處可見，其傳播介體在國內也多有分布。當前，上海地區尚未在野外發現TRV的發生分布，針對2021年在崇明舉辦的第十屆花博會，相關單位和部門有針對性地對多批次的花卉種球進行檢驗，防止其通過重大工程等途徑傳入上海，一旦其在上海定殖擴散，防治難度極大。在充分了解TRV生物學特性的基礎上，建立準確、快速的檢測方法，制定有效的防范措施，對入駐花博會的種苗加強檢測和鑒定，杜絕傳染源，切斷其傳入途徑，確保崇明世界級生態島和上海城市的生態安全。