血栓靶向相變納米粒穿透深度與其溶栓效果相關性的實驗研究

鐘毅欣 葉曼 徐杰 張文麗 胡柳 方霓 郭大靜

動脈血栓性疾病具有較高的致死率和致殘率［1］，阿替普酶作為美國食品藥品管理局唯一批準的溶栓藥物，其臨床應用具有一定優勢，但由于其較窄的時間窗和未知的副作用，廣泛應用受到限制［2］。以納米技術為基礎的分子影像學因其制備簡單、多用途的整合功能備受關注，有望突破這一瓶頸［3］。本課題組前期已成功構建靶向血栓相變型納米粒，低強度聚焦超聲（LIFU）致全氟己烷（PFH）相變溶栓，體內外實驗均取得了良好效果［4-5］。本實驗在前期研究的基礎上，建立動脈血栓的體外模型，進一步分析納米粒穿透血栓深度與溶栓效果的相關性，探討聲致相變的納米粒在動脈血栓中的應用價值。

材料與方法

一、實驗動物

健康雌性新西蘭大白兔5只，體質量4.5～5.0 kg，平均（4.75±0.25）kg，均購于重慶醫科大學動物實驗中心。雌性SD大鼠10只，10～12周齡，體質量280～320 g，平均（290.00±12.80）g，均于SPF級動物喂養中心進行飼養。所有實驗操作均經重慶醫科大學動物倫理委員會批準。

二、主要實驗試劑與儀器

1.主要試劑：聚乳酸羥基乙酸（PLGA，分子量8000，濟南岱罡生物工程有限公司）；PFH（北京百靈威科技有限公司）；CREKA多肽、人纖維蛋白原（江蘇強耀生物科技有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、2-嗎啉乙磺酸（MES）、聚乙烯醇（美國Sigma-Aldrich公司）；異丙醇、二氯甲烷（成都科龍公司）；Di I染色劑（上海碧云天生物技術有限公司）；OCT包埋劑（日本櫻花公司）；PBS溶液（武漢賽維爾公司）；戊巴比妥鈉（吉林大學醫學院自制）。

2.主要儀器：超聲波破碎儀（美國Sonics公司）；共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）；LIFU治療儀（重慶海扶醫療科技股份有限公司）；馬爾文粒徑儀（Zetasizer Nano ZS90，英國馬爾文儀器有限公司）；透射電子顯微鏡（H 7500，日本日立公司），流式細胞儀（FACS Vantage，美國Becton Dickinson公司）；倒置熒光顯微鏡（CKX41，日本奧林巴斯公司）。

三、實驗方法

1.制備靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒：通過改良的W/O/W雙乳化揮發方法制備相變型納米粒。取50 mg PLGA溶于2 ml二氯甲烷，加入200μl的PFH溶液作為內水相，冰浴下超聲波破碎儀工作1 min，功率30 W；加入4%聚乙烯醇溶液5 ml作為外水相，繼續聲振1 min，功率30 W；然后加入10 ml濃度2%的異丙醇溶液，冰浴下攪拌3 h，使PLGA-PFH納米粒表面固化。根據碳二亞胺法將制得的PLGAPFH納米粒離心洗滌后，用0.1 M的MES（pH值5.2）溶液重懸，EDC和NHS按照摩爾比2∶1加入，冰浴條件下孵育3 h。去除未反應的EDC、NHS，加入0.1 M的MES（pH值8.0）重懸后加入5 mg CREKA多肽，冰浴條件下孵育12 h，即制得PLGA-PFH-CREKA納米粒，置于4℃冰箱中備用。

2.靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒的理化特性：以1 ml的注射器將樣品滴于銅網上，待完全干透后置于透射電鏡下觀察其結構；馬爾文粒徑儀測量納米粒大小及表面Zeta電位；流式細胞儀半定量分析納米粒與CREKA多肽的連接率。將其置于特定的凝膠模具中，使用LIFU（1 W/cm2）輻照15 min，于光鏡下觀察輻照前后納米粒的形態變化。

3.靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒對體外血栓深度的穿透性：采血針穿刺入新西蘭大白兔耳緣動脈，10 ml負壓采血管收集血液，置于37℃的水浴鍋4 h，將血塊切成小塊（大小1.0 cm×0.3 cm×0.3 cm，重約300 mg），PBS溶液清洗3次。PLGA-PFH-CREKA納米粒用DiI染色劑標記，將血凝塊置于自制的凝膠模具中，加入PLGA-PFH-CREKA納米粒為兔靶向PT組，不加CREKA多肽的納米粒為兔非靶向PT組，以相同容量的雙蒸水替代PFH為非相變組（NPT組）。將制得的納米粒按照2 mg/ml的濃度配置成25 ml，LIFU（1 W/cm2）輻照2 h，焦距28 mm，然后用濾紙吸去血凝塊表面的水分，記錄其質量，計算溶栓率，公式為溶栓率=（溶栓前質量-溶栓后質量）/溶栓前質量×100%。血凝塊以OCT包埋，制作冰凍切片，厚度50μm，置于共聚焦顯微鏡下觀察血栓穿透深度（即血栓邊緣到熒光消失的距離）。

4.靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒對體內血栓的靶向性：以1%戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠，建立腹主動脈附壁血栓模型，將Alexa 488標記的人纖維蛋白原（10 mg/kg）注入尾靜脈，備皮后打開腹腔，止血鉗游離腹主動脈，10%氯化鐵溶液浸濕濾紙，包裹其外周1圈，4 min后取出濾紙，并用生理鹽水清洗。SD大鼠隨機分為兩組，分別注射1 mg/ml濃度的DiI染色劑標記的靶向納米粒（大鼠靶向PT組）和非靶向納米粒（大鼠非靶向PT組）。待血液循環3 h后處死動物，取出該段腹主動脈，生理鹽水清洗2次，OCT包埋，制作冰凍切片后倒置于熒光顯微鏡下觀察納米粒的體內靶向性。

四、統計學處理

應用SPSS 22.0統計軟件，計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析；兩組比較行Post-hoc事后檢驗。應用線性回歸分析溶栓率與血栓穿透深度間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、PLGA-PFH-CREKA納米粒的理化特性

制備的PLGA-PFH-CREKA納米粒平均粒徑為（297.8±11.82）nm，表面平均電位為（1.44±0.22）mV，多分散系數為0.067±0.038。透射電鏡顯示納米粒為均勻球體，分散性好（圖1A）。流式細胞儀檢查示在隨機計數的10000個納米粒中，有9534個納米粒波長發生了改變，即95.34%的納米粒與CREKA多肽成功連接。LIFU輻照前后可見納米粒明顯膨脹（圖1B、C）。

圖1 靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒的理化特性

二、靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒對體外血栓深度的穿透性

LIFU輻照2 h后，各組對體外血栓深度的穿透性見圖2。共聚焦顯微鏡顯示兔靶向PT組血栓深處可見熒光；兔非靶向PT組血凝塊邊緣熒光強度較弱，其深部未見明顯熒光分布；NPT組血凝塊邊緣可見熒光分布，但血凝塊深部未見明顯熒光信號。兔靶向PT組、兔非靶向PT組、NPT組對血栓的穿透深度分別為（293.01±24.61）μm、（114.52±23.85）μm、（116.78±28.06）μm，差異有統計學意義（F=96.187，P<0.001）；兔靶向PT組與兔非靶向PT組和NPT組比較差異均有統計學意義（均P<0.001），NPT組與兔非靶向PT組比較差異無統計學意義。兔靶向PT組、兔非靶向PT組及NPT組靶向溶栓率分別為（60.67±4.37）%、（45.83±6.88）%、（18.67±1.78）%，差異有統計學意義（F=108.508，P<0.001）；組間兩兩比較差異均有統計學意義（均P<0.001）。

圖2 各組血栓切片的激光共聚焦三維重建圖（×200）

三、相關性分析

線性回歸分析顯示，兔靶向PT組的溶栓率與血栓穿透深度之間存在線性相關（R2=0.818，P<0.05）；兔非靶向PT組、NPT組的溶栓率與血栓穿透深度之間無明顯相關（R2=0.005、0.021）。

四、靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒的體內靶向性

大鼠靶向PT組中，DiI染色劑標記的納米粒呈紅色，其與Alexa 488標記的纖維蛋白分布大部分一致。大鼠非靶向PT組中，DiI染色劑標記的納米粒紅色熒光較少，在通道合并圖片中未與纖維蛋白明顯重合（圖3）。

圖3 大鼠靶向PT組與大鼠非靶向PT組體內熒光圖（×100）

討論

早期發現和及時治療對于動脈血栓形成患者的遠期康復至關重要。目前的治療方式主要使用靜脈給藥或通過介入手術的方式直接動脈給藥，但由于阿替普酶在血液循環中不受限制，會導致患者出現癥狀性顱內出血、缺血再灌注損傷及神經中樞中毒等癥狀。因此，臨床亟需探尋一種效益高、劑量可控的方式。通過雙乳化法制備的PLGA-PFH-CREKA納米粒由于其良好的生物相容性，已在納米給藥系統中引起廣泛關注，相較于單乳化法，雙乳化法可提高親水性材料的包封率［6］。同時，分子量8000的PLGA聚合鏈短，降解速度更快，可保證納米粒的安全性，這一點在前期研究［4-5，7］中也得到證實，故本實驗采用雙乳化法制備靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒。

除外制備方式，粒徑大小作為血管內給藥的一項關鍵參數也值得注意。研究［8］顯示，粒徑<10 nm的粒子通常經腎臟濾過和組織外滲而排出，>20 nm的粒子通過網狀內皮系統在血液循環中清除，而粒徑為300 nm的粒子適用于血管內給藥，且血管內給藥的有效性具有獨特優勢，因此，本實驗制備的PLGA-PFH-CREKA納米粒大小均勻，分散性較好，粒徑在300 nm左右，適用于血管內血栓的研究。與前期研究［5］相比，本實驗未加入氧化鐵納米粒，原因在于相變型納米粒的溶栓主要與PFH和超聲的聯合作用有關，氧化鐵的目的在于顯像，但從顯像的角度出發，需要研發一種效果更佳、更靈敏的集診療一體化的納米粒，故本實驗未加入除PFH的其他顯像劑。

液態氟碳是含氟脂肪族化合物的一種，近年來主要用于超聲和MRI顯像，其特殊的液氣相變過程為腫瘤治療帶來了新方法［9］。前期研究［5］選擇攜PFH及氧化鐵的相變型納米粒進行溶栓實驗，發現LIFU的聲功率密度僅需1 W/cm2即可將該納米粒激活，使其從液態轉變為氣態，達到破壞血栓的目的。為進一步驗證在1 W/cm2LIFU的輻照下相變型納米粒穿透血栓的深度對溶栓效果的影響，本實驗制備了未攜帶氧化鐵的PLGA-PFH-CREKA納米粒，其在溶栓方面也展現出一定優勢，經LIFU輻照2 h后，兔靶向PT組的血栓穿透深度為（293.01±24.61）μm，而兔非靶向PT組和NPT組 的 血 栓 穿 透 深 度 分 別 為（114.52±23.85）μm、（116.78±28.06）μm，推測在LIFU的作用下，通過超聲的熱效應、機械效應等物理作用可以使血栓疏松，有助于納米粒滲透，與腫瘤的相關研究［10］結論類似。本實驗結果顯示，兔靶向PT組的溶栓率與血栓穿透深度呈正相關（R2=0.818，P<0.05），證實靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒對血栓的穿透深度在一定程度上可影響治療效果，值得今后進一步探究。

在血栓形成過程中，纖維蛋白有重要作用，與抗體相比，本實驗采用靶向纖維蛋白的多肽，血液清除率和穿透纖維蛋白網的能力均更佳，可進一步提高目標背景比［11］。體內靶向性實驗顯示大鼠靶向PT組中DiI染色劑標記的納米粒呈紅色，其與Alexa 488標記的纖維蛋白分布大部分一致，進一步證實攜CREKA多肽的納米粒較未攜帶的納米粒在血栓區域的滯留更多，說明攜CREKA多肽的納米粒具有良好的靶向性。另外，本實驗結果顯示，兔靶向PT組與兔非靶向PT組溶栓率比較差異有統計學意義（P<0.001），說明攜帶靶向纖維蛋白的CREKA多肽可放大PLGA-PFH-CREKA納米粒的溶栓效果。但受LIFU探頭輻照面積和深度衰減的影響，相變型納米粒的溶栓效果還需進一步提高，今后可通過改進LIFU設備、相變型納米粒的響應機制及對血栓穿透的機制進行解決，這也是未來研究的方向。

綜上所述，本實驗成功制備靶向纖維蛋白的PLGA-PFH-CREKA納米粒，對血栓纖維蛋白有良好的靶向性，且與血栓穿透深度相關。這種以相變型納米粒作為溶栓介質的方法，有望通過其機械作用及擴大溶栓治療的時間窗為臨床治療方式的研究帶來新思路。