細胞凋亡超聲成像早期評估腫瘤治療反應的研究進展

趙萍 段云友

目前，癌癥是威脅我國人民健康的主要公共問題，也是主要死亡原因。細胞凋亡在癌癥治療中具有重要作用，與癌癥的發生發展密切相關［1］。現有的手術、放療、化療、免疫療法及靶向藥物等治療手段均是以激活細胞凋亡作為殺死癌細胞的主要途徑［2-4］，表明實時監測細胞凋亡水平已成為早期評價腫瘤治療反應的一項指標。影像學成像技術監測細胞凋亡水平有助于臨床全面了解腫瘤發展情況，實時指導治療方案，對預后效果的評估也具有重要意義。本文就超聲成像在細胞凋亡監測中的研究進展及在早期評估腫瘤治療反應中的應用進行綜述。

一、高頻超聲在細胞凋亡中的應用

細胞凋亡的典型特征是細胞皺縮、質膜出泡、細胞器或核膜周圍的染色質濃縮、DNA片段化等細胞結構與亞細胞結構的改變［5］。既往有學者［6-8］利用超聲對組織結構的敏感性檢測體內細胞凋亡，顯示出良好的效果。Tadayyon等［9］應用高頻超聲（40～50 MHz）開展細胞死亡診斷研究發現，凋亡區超聲反射信號強度最高可增加16倍。由于化療引起的凋亡組織與周邊結構的聲阻抗存在差異，Pasternak等［10］以高頻超聲（頻率>20 MHz）成像技術定性和定量評估癌細胞的死亡程度和死亡類型，進而評估化療療效。盡管以上研究極大地推進了超聲成像對細胞凋亡的研究進展，但其使用的超聲頻率高于大多數臨床設備使用頻率。換能器頻率越高，聲波的穿透性就越低，這種超聲信號的高度衰減，使穿透深度多為1～5 cm［11］，限制了臨床對某些深部腫瘤病變的診斷。最重要的是，高頻超聲診斷仍基于解剖學水平，顯示的是部分分子改變的終效應，并非治療反應早期的分子水平事件，且缺乏特異性和敏感性，臨床應用受限。

二、超聲分子成像在細胞凋亡中的應用

超聲分子成像是研究活體內具有重要作用的關鍵蛋白分子成像情況，具有無創、實時、便捷等優勢［12］，其成像基礎和先決條件是開發具有特異性高、敏感性強、靶向性好的超聲分子探針［13］。基于該原理，超聲分子成像評價細胞凋亡的基礎就是開發具有靶向凋亡細胞的特異性分子成像探針。以下對不同靶向分子探針在細胞凋亡中的應用進行綜述。

1.靶向磷脂酰絲氨酸（PS）的分子探針：PS是細胞膜上的主要磷脂之一，占磷脂總含量的2%～10%［14］。正常細胞中，PS位于細胞膜內側，但在細胞凋亡發生早期，PS可從膜內側翻轉到膜表面，暴露于細胞外環境中。因此，PS是暴露于凋亡早期的生物標志物，靶向PS的分子探針已被廣泛用于凋亡成像研究。Annexin V（AV，也稱Annexin A5）作為一種磷脂結合蛋白，能以Ca2+依賴方式以納米級親和力與PS高度結合［14］。Min等［15］在普通微泡上連接Annexin A5對阿霉素誘導的兔心臟平滑肌細胞進行凋亡監測，結果表明該靶向造影劑能增強治療早期凋亡的成像效果。Wei等［16］以人源Her-2陽性乳腺癌接種后的鼠移植瘤為模型，將納泡連接AV用于凋亡靶向成像，結果顯示藥物曲妥單抗的療效良好。2018年，本課題組［17］以AV為分子探針制備了一種靶向納米級脂質納泡AV-Nanobubbles（AV-NBs），用于評價腫瘤對治療的反應，發現AV-NBs可特異性聚集于順鉑誘導的乳腺荷瘤裸鼠體內異位移植瘤細胞凋亡區，超聲靶向分子成像顯示凋亡區呈現明顯高增強，且AV-NBs在靶區的滯留時間較普通納泡和聲諾維更長；該研究為無創、監測活體抗腫瘤反應，以及早期精準評價療效提供了參考。Annexin V-128是AV的突變體，其N端包含更多結合位點。相較于AV，Annexin V-128在腎臟的代謝更快，對腎臟毒性作用更低，其N段結構域較AV更長；但二者誰更具優勢尚不清楚［14］。除以上蛋白和抗體類探針外，還有多肽類及小分子類探針也被用于不同成像模式中靶向PS的凋亡成像［18］。

2.靶向磷脂酰乙醇胺（PE）的分子探針：PE占細胞膜總磷脂的20%～40%，分布豐度較PS更高［16］。與PS類似，PE外化到細胞表面是凋亡早期標志，可作為凋亡分子成像的理想靶點。有學者［19］設計了一種具有靶向PE的分子成像探針，通過巨噬細胞凋亡顯像來預測動脈粥樣硬化斑塊風險及易損性，顯示出良好的前景。Duramycin是由19個氨基酸組成的低分子量多肽，對PE敏感性高，靶向結合能力強，在輻射/化療誘導組織損傷、結直腸癌、乳腺癌及動脈粥樣硬化等動物模型中已有研究［20］，其具有極強的靶向凋亡細胞能力，且對腎臟的毒副作用低。但Duramycin尚未被用于超聲分子成像領域，具有一定的開發空間。

3.靶向組蛋白（Histone）H1的分子探針：Histone H1是凋亡早期暴露于細胞表面的一種新的標志物［14］。Lee等［21］開發了一種高親和力的Histone H1結合肽，命名為ATPHH1，發現其在藥物誘導的腫瘤凋亡監測中具有良好效果，且用量低于凋亡靶向肽-1（ApoPep-1）。ApoPep-1是由一種噬菌體展示技術鑒定而得，由6個氨基酸組成的短肽，分子量較小，以Ca2+非依賴方式靶向Histone H1，是一種理想的評價早期細胞凋亡的分子影像探針［21］。研究［22］表明，ApoPep-1對化療誘導的腫瘤細胞凋亡檢測較AV更敏感。本課題組以ApoPep-1為分子探針設計了一種新的靶向納泡［23］，生物素化后的ApoPep-1分子量僅為982 Da，較前期使用的AV-NBs穩定性更好，在腫瘤組織內存留時間更長，極大地提高了靶向凋亡區的成像效果，為提高腫瘤治療反應的評價能力提供了更多實驗依據，表明ApoPep-1作為凋亡分子成像探針具有極大優勢。

4.靶向活化的Caspases-3/7的分子探針：Caspase是一組存在于細胞質中的半胱氨酸蛋白酶，在凋亡的啟動和執行中均具有關鍵作用［24］。Caspases-3/7是兩個重要的執行酶，二者的激活是凋亡成像的理想靶點。由于凋亡細胞膜是完整的，因此，靶向Caspase 3/7的分子探針必須具有細胞膜通透性，才能進入細胞內識別Caspase 3/7，這與靶向胞外凋亡標志物如PS、PE和Histone H1等不同［14］。目前，已開發的靶向活化Caspases-3/7的探針如WC-Ⅱ-89、WC-4-116、ICMT-11、ML-10、VAD-FMK、MICA-302、CP-18及C-SNAT等主要在PET中顯示出凋亡監測能力［15，17］，其是否能用于超聲分子成像領域，尚需今后進一步探索。

三、展望

目前，基于超聲分子成像評價細胞凋亡的研究尚處于早期研究階段，相較于MRI、PET、單光子發射計算機斷層成像等凋亡成像研究，靶向凋亡的超聲分子探針還有極大的開發空間。細胞凋亡過程涉及多個生物標志物，篩選理想的超聲分子探針仍具有挑戰。未來，在發揮細胞凋亡不同生物標志物的特性和優勢的基礎上，開展大量基礎研究工作，以充分發掘敏感性和特異性更高、對機體毒副作用更低的超聲分子成像探針，將為細胞凋亡超聲成像及腫瘤治療反應的早期評估提供更多選擇。