花生AhFAD2-1基因啟動子及5'-UTR內含子功能驗證及其低溫脅迫應答

石 磊 苗利娟 黃冰艷 高 偉 張忠信 齊飛艷 劉 娟 董文召 張新友,*

花生基因啟動子及5'-UTR內含子功能驗證及其低溫脅迫應答

石 磊1,2苗利娟1,2黃冰艷1,2高 偉3張忠信1,2齊飛艷1,2劉 娟3董文召1,2張新友1,2,*

1河南省農業科學院河南省作物分子育種研究院 / 農業農村部黃淮海油料作物重點實驗室 / 河南省油料作物遺傳改良重點實驗室 / 花生遺傳改良國家地方聯合工程實驗室, 河南鄭州 450002;2河南生物育種中心有限公司, 河南鄭州 450002;3河南省農業科學院經濟作物研究所, 河南鄭州 450002

D12-脂肪酸脫氫酶基因()催化油酸生成亞油酸, 是決定油酸亞油酸比值的關鍵基因。高油酸花生對低溫更加敏感, 暗示在低溫響應中發揮作用。為探索花生的低溫脅迫應答, 本研究分析了花生的基因結構, 從普通油酸花生品種豫花9326中克隆了啟動子和內含子, 并通過轉化擬南芥驗證了功能及其對冷脅迫的應答。結果表明,包含2個外顯子和1個位于5'-UTR的內含子;基因啟動子功能較弱, 僅啟動子在子葉期幼苗的子葉葉尖中觀察到藍色;假基因5'側翼序列具有啟動子活性, 可調控基因在子葉、下胚軸、種子中表達。內含子序列具有啟動子的功能, 驅動基因在幼苗下胚軸及子葉中表達, 同時還有提高基因表達效率和擴大表達范圍的功能, 是基因表達調控必需元件; 包含5'-UTR內含子的啟動子的調控序列功能受低溫脅迫抑制。

花生; Δ12-脂肪酸脫氫酶基因(); 啟動子; 內含子介導增強; 冷脅迫; GUS報告基因

花生(L.)廣泛種植于熱帶、亞熱帶和溫帶地區, 其種子脂肪含量在50%左右, 是重要的油料作物之一。我國花生年種植面積約460萬公頃, 產量約1700萬噸(http://zzys.agri.gov.cn/ nongqing.aspx), 占世界總產量的40%左右, 是世界上最大的花生生產國。我國也是世界上最主要的花生消費國, 總產量的一半用來榨油, 花生油營養豐富, 氣味醇香, 深受消費者喜愛。花生油中不飽和脂肪酸油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)含量約占脂肪酸總量的80%, 高油酸花生中油酸含量大于75%, 普通花生中油酸含量在35%～60%之間[1]。油酸比亞油酸更有益于健康, 并且有更好的風味[2-3]和更穩定的化學性質, 按照不同檢測方法計算, 油酸的氧化穩定性比亞油酸高3.4～14.5倍[3], 導致高油酸花生及其制品不易酸敗, 有更長的貨架期。因此油酸含量很大程度上決定了花生油及其他花生制品的品質, 是評價花生品質的重要指標, 受到了育種家的高度關注, 培育和推廣高油酸花生品種成為當前熱點。

Δ12-脂肪酸脫氫酶基因(,)通過催化油酸脫C12上的2個氫而引入雙鍵生成亞油酸[4], 是決定油酸含量的關鍵基因。的自然突變或化學誘變[5-9]以及通過基因工程方法沉默該基因[10-13]都可以產生高油酸性狀。研究表明, 通過提高細胞膜的流動性, 多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFAs)在動植物適應冷脅迫過程中發揮重要作用[14], PUFAs中的亞油酸含量在擬南芥[15]、大豆[16]中會隨著溫度的降低顯著升高。基因直接參與細胞膜冷脅迫適應過程[17], 橄欖中參與低溫響應[18-19], 棉花、花生、生菜冷脅迫后表達量顯著升高[17,20-22], 擬南芥突變體低溫條件下不發芽[23]。還參與其他非生物脅迫, 如擬南芥突變體耐鹽能力顯著下降[24], 部分受光調控[17], 植物特有防衛相關化合物聚乙炔(polyacetylene)在生物合成前期受催化[25]。與普通花生相比, 高油酸花生在種子發芽期對低溫敏感, 出苗率低[26]。研究花生調控區功能及其對低溫脅迫的響應, 對解析高油酸花生的耐低溫性具有重要的意義。

本研究從普通油酸花生品種豫花9326中克隆了的調控序列, 并對序列及其順式作用元件進行了分析, 通過轉化擬南芥驗證了功能及其對冷脅迫的應答, 旨在為解析和提高高油酸花生的耐寒性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 花生(L.)品種豫花9326由本實驗室選育, 為普通油酸花生, 種植于河南省農業科學院試驗基地。Columbia生態型擬南芥, 由本實驗室保存, 種植于22℃ 16 h光照/ 20℃ 8 h黑暗的植物生長培養箱。

1.1.2 菌株及質粒 農桿菌菌株GV3101、植物表達載體pBI121由本實驗室保存。大腸桿菌JM109感受態、pMD18-T克隆載體購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.1.3 試劑 植物DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司; 限制性內切酶、連接酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、Prime-Script RT Reagent Kit等購自寶日醫生物技術(北京)有限公司; PCR引物合成及DNA測序由北京六合華大基因科技有限公司完成; 其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 AhFAD2-1 5'端側翼序列、內含子的克隆

利用花生基因(EF192432.1)序列, 在花生基因組信息網(https://www.peanutbase.org/home)中進行BLAST比對, 獲得花生基因5￠端側翼序列及內含子序列, 根據核苷酸序列設計引物(表1), 以花生葉片gDNA為模板進行PCR擴增, 擴增體系10 μL, 包括模板0.2 μL、5× PrimeSTAR GXL緩沖液2 μL、2.5 mmol L–1dNTPs混合物0.8 μL、10 μmol L–1上游及下游引物各0.5 μL、PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶(1.25 U μL–1) 0.2 μL, ddH2O補齊至10 μL。反應條件為98℃變性10 s, 55℃退火15 s, 68℃延伸5 min, 35個循環; 68℃延伸10 min。1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物, 切膠回收, 克隆至pMD18-T載體并測序。

表1 本研究所用引物及其序列

1.3 AhFAD2-1啟動子序列分析

利用植物啟動子在線分析網站PLACE (https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)和plantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)分析可能的順式作用元件。

1.4 AhFAD2-1啟動子及內含子缺失表達載體構建

根據引入的酶切位點, 分別選擇對應的I和I或I和I對PCR擴增產物進行雙酶切, 用T4 DNA連接酶分別連接到經對應雙酶切后的pBI121質粒上, 替換其CaMV35S元件, 構建重組植物表達載體pBI-P+intron、pBI- P+intron、pBI-P(pseudo)、pBI-P、pBI-P、pBI-、pBI-AhFAD2- 1B intron、pBI-AhFAD2-1B intron。轉化大腸桿菌感受態, 利用PCR擴增、雙酶切及測序(5￠-GGAA TTGTGAGCGGATAAC-3￠; 5￠-GCCCGGCTTTCTTG TAAC-3￠)鑒定陽性克隆。提取質粒, 凍融法轉化上述7個載體及pBI121至農桿菌中, 鑒定陽性克隆, 保存于-80℃備用。

1.5 擬南芥轉化及GUS組織化學染色

花序浸染法轉化擬南芥。收集成熟種子, 在含50 mg L–1卡那霉素MS固體培養基上篩選抗性植株。CTAB法提取綠色健壯抗性苗DNA, 用轉化載體中對應的特異引物PCR擴增鑒定陽性植株, 反應條件為: 94℃ 5 min; 95℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 3 min, 35個循環; 72℃ 10 min。

對T2代種子進行Kan抗性追蹤, 后代中綠苗和黃化苗比例接近3∶1的為單拷貝株系。取單拷貝株系的幼苗、根、莖、葉、花、角果、種子等組織置于GUS染色液(X-gluc 0.5 g L-1, 50 mmol L-1pH 7.0磷酸緩沖液, 10 mmol L-1EDTA, 0.5 mmol L-1鐵氰化鉀, 0.5 mmol L-1亞鐵氰化鉀, 0.01% Triton X-100, 20%甲醇)中, 抽真空10 min, 37℃溫浴過夜。用乙醇乙酸混合液(體積比為1∶1)將染色組織脫至無色, 分別用75%、50%、25%的乙醇洗滌3次, 顯微鏡下觀察, 并采集圖像。每個轉化載體隨機至少選取4個單拷貝獨立轉化株系進行GUS染色分析, 保證其中3個株系染色結果一致。

1.6 脅迫試驗

轉基因擬南芥種子播種于含50 mg L–1卡那霉素MS固體培養基上, 待出現第1片真葉后, 分別放置于10℃ 16 h光照/ 8℃ 8 h黑暗、15℃ 16 h光照/ 13℃ 8 h黑暗、22℃ 16 h光照/ 20℃ 8 h黑暗、30℃ 16 h光照/ 28℃ 8 h黑暗的植物生長培養箱中進行溫度脅迫試驗, 于1、2、4 d分別取樣染色。

2 結果與分析

2.1 AhFAD2-1基因分析及啟動子、內含子的克隆

通過BLAST比對, 獲得了3個同源序列, 1個位于Arahy 9 (A09)染色體114194542～ 114195863 (Identity=98.49%)之間, 命名為; 另2個分別位于Arahy 19 (B09)染色體154049703～ 154048379 (Identity=100%)和152798019～152796774 (Identity=97.04%) (pseudogene)之間, 后者序列中的開放閱讀框(open reading frame, ORF)對應區第451位堿基由G突變為T (G451T), 形成終止密碼子TAA, 同時在673位堿基后存在1個GACTCAG的7 bp序列插入(圖1), 導致該基因只能編碼150 aa, 不能翻譯成完整379 aa的FAD2-1編碼蛋白, 因此為假基因, 這2個基因位點分別命名為和()。通過cDNA與DNA的序列比對,包含2個外顯子和1個內含子, 其中1個外顯子包含了整個ORF區, 另1個外顯子和內含子位于起始密碼子ATG上游的非翻譯區(圖1)。

以豫花9326基因組DNA為模板, 克隆了、轉錄起始位點5￠上游1575 bp和2027 bp啟動子序列, 分別命名為P和P(圖1); 克隆了、和()起始密碼子ATG 5￠上游包含啟動子和內含子的3247、3684和2967 bp序列, 分別命名為P+intron、P+intron和P(pseudo)(圖1); 克隆了的1567 bp內含子序列, 命名為; 克隆了內含子缺失片段, 命名為AhFAD2-1-intron、AhFAD2- 1B-intron。將上述目的片段連接到pBI121載體中, 對重組質粒進行測序鑒定, 獲得了陽性重組質粒。

TSS: 轉錄起始位點。TSS: the transcription start site.

2.2 AhFAD2-1啟動子生物信息學分析

應用在線分析網站PLACE和plantCARE對花生P、P及內含子序列進行生物信息學分析。P起始轉錄位點上游-24 bp (TAT AAA)或-45 bp (TATA)存在可能的真核生物RNA聚合酶II結合位點TATA-box, 在-90 (CAAT)、-97 (CAAT)或-115 bp (CCAAT)存在可能的增強轉錄作用的CAAT-box; P的TATA-box可能位于-25 bp (ATTATATAA), CAAT-box可能位于-61 bp (CAAT)或-113 bp (CAAAT)。

和起始密碼子ATG 5￠上游序列具有同源性, 其中內含子序列同源性為94%, P序列的-33～-679 bp與P序列的-1345～-1982 bp同源性為86% (圖1)。P特異性序列中發現有多種種子表達相關元件, 如DPBFCOREDCDC3 (ACACNNG)、PYRIMIDINEB OXOSRAMY1A (CCTTTT)、SEF4MOTIFGM7S (RTTTTTR)、ACGTABOX (TACGTA)等。P特異性序列中發現有葉肉細胞或葉片表達相關作用元件, 如MYBCORE (CNGTTR)、CACTFTPPCA1 (YACT)、RAV1AAT (CAACA)、MYBCORE (leaf)、DOFCOREZM (AAAG)、GATABOX (GATA)等。兩者同源序列中發現了多種種子表達相關順式作用元件, 如RY-element (CATGCATG)、SEF1MOTIF (ATATTTAWW)、DPBFCOREDCDC3 (ACACNNG)、SEF4MOTIFGM7S (RTTTTTR)、SEF3MOTIFGM (AACCCA)和EBOXBNNAPA (CANNTG)等; 根表達相關作用元件, 如ROOTMOTIFTAPOX1 (ATATT)、OSE2ROOTNODULE (CTCTT)、AUXREPSIAA4 (KGTCCCAT)、RAV1AAT (CAACA)。除此之外還有多種生物脅迫和非生物脅迫響應順式作用元件: 低溫響應作用元件或熱激元件LTR (CCGAAA)、CCAATBOX1 (Heat shock element) (CCAAT)、MYCCONSENSUSAT (CANNTG); 鹽誘導響應作用元件GT1CONSENSUS (GAAAAA); 光響應作用元件G-Box (CACGTT、TAAACGTG、TACGTG)、Box 4 (ATTAAT)、GT1-motif (GGTTAA); 茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif (CGTCA)和TGACG-motif (TGACG); 脫落酸響應元件ABRE (ACGTG); 赤霉素響應元件GARE-motif (TCTGTTG)和TC-rich repeats (GTTTTCTTAC)等。

2.3 AhFAD2-1啟動子、內含子及假基因5'側翼序列功能分析

GUS染色結果如圖2所示, P經過染色后未發現任何組織具有顯示GUS活性的藍色; P僅在子葉期幼苗的子葉葉尖處觀察到藍色, 隨著苗齡增加藍色消失, 其他組織未發現藍色。

序列具有啟動子活性, 可以驅動GUS基因的表達, 在幼苗期的下胚軸及子葉中觀察到藍色, 當內含子缺失掉大部分序列, 僅保留與假基因同源的片段時(tron和AhFAD2-1B-intron), 沒有觀察到染色后呈藍色的組織, 說明該同源序列不能發揮啟動子的功能; P+intron在苗期的子葉和下胚軸中顯示藍色, 進入生殖生長期后, 擬南芥種子中的胚被染成藍色; P+intron子葉期幼苗子葉、下胚軸和根尖顯示藍色, 隨著苗齡增加, 蓮座葉及莖生葉染為藍色, 下胚軸藍色消失, 進入生殖生長期后, 花萼、柱頭、角果皮、種皮及胚都顯示藍色。綜合以上結果, P序列融合了內含子后, 其啟動效率及表達范圍都有明顯變化, 內含子增強了啟動子的啟動效率并擴大了啟動范圍。

P(pseudo)也具有啟動子活性, 在幼苗子葉和下胚軸處觀察到了藍色, 進入生殖生長期后, 擬南芥種子中的胚被染成藍色。

2.4 低溫脅迫對PAhFAD2-1A+intron和PAhFAD2-1B+ intron的影響

高油酸花生種子在發芽期對低溫較為敏感, 為探討基因是否參與花生對低溫脅迫的響應, 觀察了轉P+intron和P+intron擬南芥幼苗在不同溫度處理下的染色情況。30℃環境中, P+intron驅動GUS在擬南芥根尖中表達, 而正常生長的22℃環境中在根尖中不表達, 其他組織中的表達模式沒有變化, 隨著溫度的降低和時間的延長, 10℃環境中第4天沒有觀察到藍色(圖3-A), 對照CaMV35S啟動子在相同條件下染色模式沒有變化(圖3-B); P+intron在30℃環境中, 第1天蓮座葉和根中沒有觀察到藍色, 子葉的藍色變淡, 第2天和第4天GUS染色模式恢復正常, 與22℃環境中擬南芥的表達模式一致, 隨著溫度的降低和時間的延長, 在10℃環境中第4天根中的藍色消失, 葉子的藍色變淡(圖4)。說明P+intron和P+intron驅動GUS基因表達的能力受到了低溫抑制。

3 討論

3.1 花生FAD2-1基因調控序列活性受低溫抑制

在發芽出苗期, 珍珠豆或多粒型花生品種溫度低于12℃, 普通型和龍生型花生品種溫度低于15℃時不能正常萌動發芽[27]。我國北方春播花生在種子萌發期會遭遇“倒春寒”等低溫傷害, 造成種子腐爛、發芽率降低, 這限制了花生在我國北方高緯度地區的推廣。盡管花生中含有多對基因[21], 遺傳分析表明花生高油酸性狀僅由1對控制, 當基因在448 bp處發生G-A突變, 導致AhFAD2-1A脫氫酶功能降低, 同時在441 bp后插入A導致AhFAD2-1B提前終止或在656和998 bp處插入微型反向重復轉座元件(miniature inverted-repeat transposable element, MITE)導致AhFAD2-1B翻譯不完全, 就引起花生的高油酸[5-6]。本研究分別克隆了的調控區域并驗證了功能以及其對低溫的脅迫應答。

A: 轉P+intron擬南芥; B: 轉CaMV35S擬南芥。1-day: 處理1 d; 2-day: 處理2 d; 4-day: 處理4 d。

A: P+intron transgenicplants; B: CaMV35S transgenicplants. 1-day: one day after treating; 2-day: two days after treating; 4-day: four days after treating.

1-day: 處理1 d; 2-day: 處理2 d; 4-day: 處理4 d。

1-day: one day after treating; 2-day: two days after treating; 4-day: four days after treating.

環境脅迫過程中植物受到傷害的主要部位是流動雙層細胞膜, 較高含量的PUFAs有助于細胞膜的流動, 有助于植物在受到低溫脅迫后維持正常功能及低溫傷害后的功能恢復[28]。基因決定了PUFAs中亞油酸的含量, 在多種植物中受低溫誘導表達[17-22], 同時擬南芥突變體的耐冷性較野生型明顯降低[23], 說明亞油酸在植物對抗低溫脅迫過程中具有重要作用。目前, 高油酸花生品種選育是花生育種的重要方向, 我國各花生育種單位通過連續回交育種結合基因標記輔助選擇技術實現了對現有推廣品種的高油酸化改良[1,29-30], 高油酸花生后代與輪回親本的細胞質遺傳物質完全一致, 細胞核遺傳物質有96%以上的相似度, 兩者主要在油酸和亞油酸含量方面存在差異, 高油酸花生中雙突變導致亞油酸含量大幅降低,推測這是生產上部分高油酸花生不耐低溫的原因。本研究發現在低溫脅迫下基因調控序列的啟動活性明顯受到抑制, 導致下游基因表達受限, 與薛曉夢等[21]分析的高油酸花生品種ZH413中在低溫脅迫下的表達模式一致, 這可能是花生對冷脅迫敏感的原因之一, 高油酸花生中亞油酸含量較普通花生亞油酸含量更低, 導致高油酸花生對冷脅迫更為敏感。花生中含有多個基因, 表達模式各不相同[21,31], 部分與表達部位重疊, 這可能在一定程度上補償了功能的缺失, 降低了高油酸花生對冷脅迫的敏感性, 薛曉夢等[21]的研究結果也認為基因表達量降低不是低溫敏感的直接原因。因此, 不同遺傳背景的高油酸品種耐寒性是否與普通花生存在差異, 還需要進一步探討, 同時在選育耐寒高油酸花生品種時, 應選用耐寒輪回親本作為改良對象, 保證后代對高緯度、寒冷地區的適應性。

3.2 FAD2-1內含子正調控啟動子活性

不同物種的基因結構保守, 都有2個外顯子和1個位于5'-UTR的內含子[11,32-33]。內含子長度變化較大, 大豆為406 bp, 油菜為1077 bp, 擬南芥為1113 bp, 水稻為3148 bp, 且序列間沒有相似性。本研究中的基因結構與其他物種相同,內含子長度分別為1603 bp和1567 bp, 序列與其他物種不具相似性。研究發現,內含子有類似啟動子的功能且對基因的表達有正調控作用。擬南芥內含子具備組成型表達活性, 與該基因5'端上游包含啟動子的2411 bp序列功能相似[24], 且受植物激素的調控[34]; 芝麻內含子不僅具備類似啟動子的功能, 其介導的調控機制還參與的種子特異性表達及其他的表達可使轉基因擬南芥中啟動子的表達效率提高100倍[35]; 油菜、內含子序列中包含TATA-box和CAAT-box, 具備啟動子活性, 同時增強上游啟動子活性[36-37]。本研究中獲得的內含子和啟動子活性較弱, 內含子對啟動子具有正調控作用, 增強了啟動子活性, 使在葉片或子葉和種子中得以表達, 這與薛曉夢等[22]分析的花生表達模式一致, 相比熒光定量PCR方法分析表達模式, 通過分析啟動子功能鑒定的表達模式在組織上可更加細化。

3.3 AhFAD2-1B假基因可能具有可執行功能

假基因是指由于個別堿基的突變或序列插入導致不能翻譯為有功能和全長蛋白的缺陷拷貝, 被認為是“基因組化石”, 主要有2種類型: 一類為“加工”型, 指mRNA轉錄本經反轉錄后重新整合到基因組中, 隨后發生提前終止、移碼突變或截斷而導致失活形成的假基因; 另一類為“非加工型”, 指基因組序列經過復制后插入到基因組, 復制基因由于功能冗余而發生失活形成的假基因, 假基因廣泛存在于生物體中[38-39]。盡管假基因是編碼蛋白的無效拷貝, 部分假基因仍可通過產生的調控RNAs (regulatory RNAs)在基本加工過程中起作用[39]。本研究中獲得的假基因()具有可執行功能的啟動子, 其起始密碼子5'上游序列含有的同源序列, 推測該假基因為“非加工型”, 是在進化過程中發生了復制, 并在長期選擇過程中發生隨機突變后形成的。在第665堿基上的MITE插入可導致AhFAD2-1B喪失油酸脫氫酶活性[6], 肖鋼等[40]通過轉化釀酒酵母證明了甘藍型油菜基因組中的6個假基因沒有功能, 推測()編碼的150 aa的蛋白序列不具備油酸脫氫酶功能, 但作為可轉錄的假基因,()是否在轉錄水平上具有調控功能還需要進一步的驗證。

4 結論

克隆了花生基因及5￠上游調控序列, 通過轉基因證明了內含子具有啟動子活性并可增強轉錄水平,基因ATG 5'上游序列驅動下游基因在種子中優勢表達,基因ATG 5￠上游序列驅動下游基因在子葉、根尖、蓮座葉、莖生葉、柱頭及胚等組織中表達, 同時調控序列的表達能力受低溫抑制。

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Characterization of the promoter and 5'-UTR intron ingenes from peanut and their responses to cold stress

SHI Lei1,2, MIAO Li-Juan1,2, HUANG Bing-Yan1,2, GAO Wei3, ZHANG Zong-Xin1,2, QI Fei-Yan1,2, LIU Juan3, DONG Wen-Zhao1,2, and ZHANG Xin-You1,2,*

1Henan Academy of Crops Molecular Breeding, Henan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Oil Crops in Huanghuaihai Plains, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Henan Provincial Key Laboratory for Oil Crops Improvement / National and Provincial Joint Engineering Laboratory for Peanut Genetic Improvement, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Henan Biological Breeding Center Co., Ltd., Zhengzhou 450002, Henan, China;3Industrial Crops Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China

Delta-12 fatty acid desaturase 2 () catalyzes the conversion of oleic acid to linoleic acid and is the determination of the level of oleic to linoleic acid ratio (O/L) in peanut oil. Peanuts with high oleic acid content are more susceptible to cold stress than those with normal oleic acid content, suggesting thatplays important roles in response to cold stress. To explore the role ofs during the process of cold stress acclimation in peanut, the genomic structures ofwere determined; the function of promoters, intron ofand their response to cold stress were characterized by using β-glucuronidase (GUS) gene reporter system in transgenic. The results were as follows:genes consisted of two exons and one intron within their 5'-UTR; promoter ofwas too weak to be detected and the promoter ofpoorly activated the expression level ofin cotyledon tip of seedlings; the promoter ofpseudogene activatedexpression limited to cotyledon, hypocotyl, and seed. The intron ofdemonstrated promoter-like activity which was restricted in cotyledon and hypocotyl, and not only enhanced the gene expression efficiency but also expanded gene expression range. Intron-mediated enhancement was an essential aspect ofexpression. Activities of 5'-flanking region ofwere repressed by the cold stress.

peanut (L.); Δ12-fatty acid desaturase gene (); promoter; intron-mediated enhancement; cold stress; GUS reporter gene

10.3724/SP.J.1006.2021.04247

本研究由國家重點研發計劃項目“大田經濟作物優質豐產的生理基礎與調控”(2018YFD1000900), 國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-13)和河南省現代農業產業技術體系項目(S2012-5)資助。

This study was supported bythe National Key Research and Development Program of China “Physiological Basis and Agronomic Management for High-quality and High-yield of Field Cash Crops” (2018YFD1000900), the China Agriculture Research System (CARS-13), and the Henan Province Agriculture Research System (S2012-5).

張新友, E-mail: haasz@126.com

E-mail: leis100@163.com

2020-11-17;

2021-03-19;

2021-03-31.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210331.1335.008.html