隴南野生中華獼猴桃實生苗初代培養體系的建立

陳 強 田鳳鳴 王永斌 劉 瓊 張曉娜

（1 隴南師范高等?？茖W校 甘肅 隴南 742500；2 隴南特色農業生物資源研究開發中心 甘肅 隴南 742500）

獼猴桃是近100 多年來由野生到人工商業化栽培最為成功的果樹種類之一，目前商業化栽培的獼猴桃類型主要為中華獼猴桃原變種。種質資源是維持產業健康發展的源頭，也是物種多樣性的載體。地處甘肅省隴南市獨特的氣候環境中的野生中華獼猴桃種質資源保存、組織培養及應用的相關研究報道較少，政府也對當地的獼猴桃產業缺乏重視。就野生獼猴桃的繁殖能力來看，一直存在一些難題。一方面，傳統實生播種方式繁殖周期長，易造成良種退化[1]，尤其是一些野生瀕危品種，存在種子繁殖能力差的問題[2]；而嫁接繁殖方式存在傷口易感潰瘍病[3]、扦插繁殖過程中生根困難、成活率低等問題[4]。另一方面，通過植物組織培養技術擴繁也存在問題，如獼猴桃外植體莖段、葉片、芽等均被有絨毛，消毒難以做到徹底，培養體系建立工作任務繁重。因此，開展獼猴桃種質資源的收集和保存，以及適合的組織快速繁殖方法，是搶救野生瀕危種質資源的重要舉措。

1 材料與方法

1.1 試驗材料。野生中華獼猴桃果實，采自隴南市文縣碧口鎮，采集完熟的果實，并剝離出種子，用自來水沖洗干凈后，放培養皿中自然陰干。最后放入紙袋中4 ℃保存備用；MS 培養基購置于杭州木木生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生獼猴桃種子無菌萌發前期處理方法。將干燥的種子放于-20 ℃冰箱中保存24 h，并做好標記，將冷凍過的種子在室溫(0～15 ℃)下處理24 h。之后轉移至燒杯，加蒸餾水100 ml，在50 ℃溫水浴中浸泡30 min，然后倒掉蒸餾水及漂浮在水面上的種子。用3 個濃度梯度的赤霉素GA3處理(3.5 mmol/L、35 mmol/L、350 mmol/L)，蒸餾水為對照，室溫條件下浸泡48 h。倒掉上述溶液，用蒸餾水沖洗4～5 次，轉到超凈工作臺，加入2%次氯酸鈉消毒10 min，倒掉消毒液，無菌蒸餾水清洗2 次，換加0.1%升汞消毒8 min[5]，倒掉消毒液，無菌蒸餾水清洗5 次。將種子接入培養皿的雙層濾紙上，封口膜包好，放入培養室(溫度25 ℃±2 ℃，相對濕度50%)，暗光條件下培養并觀察，期間第10d 在超凈工作臺補加1 次無菌蒸餾水。

1.2.2 無菌野生獼猴桃實生苗初代培養基的篩選。將獼猴桃無菌實生苗剪取根以上部分1.5 cm 左右，接到4 種不同的培養基A(1/2MS 培養基)、B(1/2 MS +1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA)、C(MS 基本培養基)及D(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA)[6]中，在溫度25 ℃±2 ℃、相對濕度50%的條件下，光照12 h(光照強度2 000 lx)，黑暗12 h。每一種培養基接種9管，每管接1 個外植體，觀察和記錄生長情況。

2 結果與分析

2.1 種子無菌萌發中赤霉素濃度效果的比較。獼猴桃種子通過處理后，在第20～30 d 期間，統計萌發情況，按照根長大于種子直徑視為發芽，結果運用SPSS19.0 統計分析了獼猴桃種子發芽情況(見表1)，赤霉素(GA3)濃度為35 mmol/L 處理的種子發芽率高達22.7%，顯著高于其他3 組。另外與對照相比，3.5～35 mmol/L GA3處理種子后的發芽率均有顯著增高，但是當GA3濃度達到350 mmol/L 后種子喪失了發芽能力。

表1 野生獼猴桃種子最終發芽率統計表

2.2 實生苗初代培養條件的篩選。將無菌野生獼猴桃實生苗分別接到4 種不同培養基中，3 周后統計可見葉片數，觀察并記錄了生長情況。試驗結果顯示，1/2MS 培養基在無菌實生苗的培養中，效果顯著低于對照，加入植物生長調節劑在本試驗中沒達到顯著作用(表2)。1/2MS 及MS 基本培養基中生長的無菌苗，有少部分出現蜷曲和玻璃化現象。另外，植物生長調節劑的加入，保證了無菌實生苗葉片正常的生長發育。

表2 無菌野生獼猴桃實生苗在不同培養基中的生長情況統計表

3 結論與討論

保護和發展野生獼猴桃資源，最便捷的保存方式就是種子的保存。然而，獼猴桃種子發芽十分困難，處理程序復雜[7]。另外，獼猴桃的葉片、莖段等外植體均被絨毛[8]。在外植體消毒到初代培養體系建立過程中污染率及褐化率較高，成活率只有約一半[9]。試驗結果中對照組種子的發芽率為2.12%(表1)，可能與種子前期消毒使用2%次氯酸鈉有關。次氯酸鈉消毒的效果不穩定，用于打破獼猴桃種子休眠更有意義[10]。另外，在獼猴桃實生苗組培研究中，初代培養最好的選擇為MS 培養基，絕大多數研究者和我們的研究結果一致，但在植物生長調節劑的使用方面，目前看來有一定的爭論。一方面，據Pedroso[11]等人報道，在獼猴桃莖段和莖尖組織培養時，在不加任何激素的MS 培養基上培養材料存活率達93%，朱道圩[12]等人報道了用獼猴桃的實生苗進行組織培養同莖段、莖尖一樣，培養基中無需附加任何激素。上述結論與表2 的結果相一致，也較好的說明本試驗中MS 培養基中組培苗與MS + 1.0 mg/L 6 - BA +0.1 mg/L NAA 培養基中組培苗葉片數差異不顯著的事實。