CAⅨ聯合CD8+TIL對宮頸癌淋巴結轉移的預測價值

楊楊 梁羅嬌 周琛斐 陳曉靜 王薇

廣州醫科大學附屬第一醫院婦產科（廣州510120）

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，淋巴結轉移是宮頸癌的主要轉移途徑和影響宮頸癌治療及預后的獨立危險因素［1］。有研究顯示，臨床上約15%～20%的宮頸癌患者在行根治性手術前已經出現淋巴結轉移，術后需加用放化療，對比單純根治性放化療，手術后追加放化療的遠期預后無明顯改善，相反雙重治療的遠期并發癥增加［2］。2018年，國際婦產聯盟組織（International Federation of Gynecology and Obstertrics，FIGO）婦科腫瘤委員會發布宮頸癌診治最新指南，術前證實淋巴結轉移，治療首選根治性放化療［3］，這對術前準確診斷淋巴結轉移提出更高的要求。目前臨床最常用的方法是MRI、CT 掃描，但敏感性及特異性偏低。PET-CT檢查、前哨淋巴結活檢術是近年新興的評估方法，但PET-CT 檢測僅提高病灶＞10 mm的淋巴結轉移準確性［4］。前哨淋巴結活檢術，由于示蹤方法和病理檢測技術的局限，假陰性率可達16.6%［5］。因此，為了規避宮頸癌患者雙重治療，尋找新的檢測方法提高術前淋巴結轉移的檢出率具有重要臨床意義。

缺氧腫瘤微環境是實體瘤的常見特征，在腫瘤轉移生物學行為中起重要作用［6-7］。課題組前期研究已證實，宮頸癌淋巴結轉移與缺氧密切相關［8］。碳酸酐酶Ⅸ（carbonicanhydraseⅨ，CAⅨ）屬于一種跨膜蛋白，是腫瘤細胞適應缺氧應激反應的調節基因，可作為腫瘤細胞缺氧的標記物［9］。CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞（tumorinfiltratinglymphocytes，TIL）是腫瘤微環境中最核心的免疫效應T 細胞，可抑制腫瘤的惡性進展及轉移，已在乳腺癌、胰腺癌等多種實體腫瘤中被證實［10］。有研究發現，多種實體腫瘤中，缺氧微環境的改善，可增加CD8+TIL 的浸潤，是抗腫瘤治療的有效靶點［11］。然而，宮頸癌中，兩者相關的研究尚未見報道。近期文獻報道，宮頸癌組織中上皮細胞激酶（epithelial cell kinase，EphA2）和轉錄因子Twist 蛋白表達量的聯合檢測可提高宮頸癌的預后判斷［12］。本研究分析CAⅨ和CD8+TIL在宮頸癌組織中的表達分布情況，探討二者的相關性及聯合檢測對于宮頸癌淋巴結轉移的預測價值，希望為宮頸癌的診治提供更多的臨床策略。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2011年至2014年廣州醫科大學附屬第一院婦產科收治的宮頸癌（按照2014年FIGO分期IB-IIA期）患者75例，無淋巴結轉移47例，有淋巴結轉移28 例。納入標準：（1）經病理活檢確診為宮頸鱗狀細胞癌；（2）術前經兩位有經驗的婦科主任醫師診斷臨床分期IB-IIA 期的宮頸癌患者；（3）既往未接受化療、放療等抗腫瘤治療；（4）所有患者或家屬均告知并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑CAⅨ、CD8 兔抗人多克隆抗體、二抗均購自英國Abcam 公司；免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色組織樣本經病理科確診入組，經4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后，3%過氧化氫封閉，加CD8 一抗的組織切片先給予2%牛血清蛋白封閉10 min，分別加入一抗（CAⅨ：1∶500，CD8：1∶200），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶1 000）37 ℃孵育30 min，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，常規脫水封片。

1.4 結果判定

1.4.1 CAⅨ的判定在高倍視野下（×200）觀察，綜合陽性腫瘤細胞百分比和染色強度進行判定：百分比評分標準：＞75%為4 分，35% ～75%為3 分，10%～34%為2 分，1%～9%為1 分，＜1%為0 分；染色強度評分標準：無染色為1 分；染色力弱（淺黃色）為2 分；中度染色（黃棕色）為3 分；染色力強（褐色）為4 分。染色指數（SI）為陽性腫瘤細胞百分比得分與染色強度得分的乘積之和。用SI 評估CAⅨ的表達，SI ＜8 確定為低表達，SI ≥8 為高表達。

1.4.2 CD8+TIL 的判定根據CD8+TIL 的染色分布，將CD8+TIL 分為癌巢內［Intraepithelial CD8+Tlymphocytes，CD8+TIL（i）］和間質內［Stromal CD8+Tlymphocytes，CD8+TIL（s）］。在高倍鏡（× 400）視野下按癌巢及間質分別隨機選取3 個視野。對視區內陽性細胞計數三次，取平均值，再取三個視野的平均值，根據CD8+TIL 中位數將患者分為低浸潤組（＜中位數）和高浸潤組（≥中位數）。

1.5 統計學方法應用SPSS 25.0和Graphpad Prism軟件進行統計分析。計量資料以中位數及四分位數間距［M（P25，P75）］表示。采用Spearman 相關分析進行相關性分析。組間結果的差異比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗。計數資料數據以n（%）的形式表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。采用logistic 二元回歸分析建立宮頸癌淋巴結轉移診斷的logistic 回歸模型，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，評估各組對宮頸癌淋巴結轉移的預測效能。所有檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05 時表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CAⅨ和CD8+TIL 的表達及相關性免疫組化染色結果顯示：CAⅨ表達位于癌巢腫瘤細胞的細胞膜，呈棕黃色顆粒狀。CD8+TIL 位于腫瘤浸潤性淋巴細胞的細胞質和細胞膜，在癌巢和間質中均有表達，呈棕黃色顆粒狀（見圖1A）。觀察到，癌巢CAⅨ表達升高往往伴隨著癌巢CD8+T 細胞浸潤數量減少，間質CD8+T 細胞浸潤數量增多（圖1A）。利用Spearman 相關性統計分析，結果顯示：CAⅨ的表達與癌巢CD8+T 細胞浸潤數量呈顯著負相關（r=-0.559 7，P＜0.001），與間質CD8+T 細胞浸潤數量呈顯著正相關（r= 0.462，P＜0.001，圖1B）。

圖1 CAⅨ、CD8+TIL 在宮頸癌中的免疫組化染色情況及其相關性Fig.1 Immunohistochemicalstainingandrelativity of CAⅨand CD8+TIL in CC

2.2 CAⅨ和CD8+TIL與臨床病理特征的關系利用χ2或Fisher 精確檢驗分析，結果顯示：在宮頸癌組織中，CAⅨ高低與淋巴結轉移有關（P=0.024），與患者的年齡、FIGO 分期、分化程度、脈管浸潤均無關（P＞0.05），癌巢、間質CD8+T 細胞浸潤高低與患者的年齡、FIGO 分期、分化程度、脈管浸潤、淋巴結轉移均無關（P＞0.05，見表1）。

表1 CAⅨ或CD8+TIL 的表達水平與臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between the expression level of CAⅨor CD8+TIL in CC patientsand clinicopathological features 例

2.3 CAⅨ聯合CD8+TIL 對淋巴結轉移的預測價值CAⅨ和CD8+TIL 在對應淋巴結有無轉移的宮頸癌組織（28 例伴有淋巴結轉移，47 例無淋巴結轉移）中的免疫得分，利用Mann-WhitneyU檢驗分析，結果顯示：在有無淋巴結轉移的宮頸癌組織中，CAIX（P= 0.001）、癌巢CD8+TIL（P＜0.001）的差異具有統計學意義，間質CD8+TIL 的差異無統計學意義（P=0.084，圖2）。

圖2 CAⅨ、CD8+TIL 在有無淋巴結轉移宮頸癌組織中的表達Fig.2 Expression of CAⅨand CD8+TIL in CC tissues with or without LNM

隨后，通過logistic 二元回歸分析構建宮頸癌淋巴結轉移聯合診斷模型。繪制CAⅨ單指標及聯合不同分布CD8+TIL 的ROC 曲線（圖3），并根據約登指數（Youden index）最大原則得到各參數的最佳診斷截斷值（cut off 值）。結果顯示：CAⅨ聯合間質CD8+TIL 具有最高的靈敏度（78.6%）、陰性預測值（83.3%），而CAⅨ聯合癌巢CD8+TIL 具有最高的特異度（100%）、陽性預測值（100%）、準確度（85.3%）以及最大曲線下面積（AUC=0.837）。綜合來看，CAⅨ聯合癌巢CD8+TIL 的檢測在預測淋巴結轉移中，具有最高的診斷效能（表2）。

表2 各參數對宮頸癌淋巴結轉移的診斷效能比較Tab.2 Comparison of the diagnostic efficiency of various parameters for LNM of CC

圖3 CAⅨ、CAⅨ聯合CD8+TIL 預測宮頸癌LNM 的ROC曲線Fig.3 ROC curve for prediction of LNM of CC with CAⅨand CAⅨcombined CD8+TIL

3 討論

隨著FIGO、美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）對于宮頸癌診治指南的不斷更新，術前區域淋巴結有無轉移直接影響宮頸癌治療方案的選擇［13］。近年來，隨著對腫瘤轉移機制的深入研究發現，腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）對于調控腫瘤惡性進展及轉移發揮重要作用，缺氧和TIL 是TME 的重要特征和主要免疫應答細胞［14］。本研究通過免疫組化法檢測宮頸癌組織病理切片中CAⅨ和CD8+TIL 的表達分布，探討二者在腫瘤微環境中的相關性，及對淋巴結轉移診斷的預測效能，為臨床提供更精準的個體化治療模式，改善患者的預后。

近年來的研究發現，缺氧（hypoxia）是TME中調控腫瘤轉移的始動因素。有研究顯示，在非小細胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種實體腫瘤中，癌細胞CAⅨ的表達與預后密切相關［9］。本課題組前期研究證明，腫瘤微環境中，缺氧促進宮頸癌惡性進展及淋巴結轉移［8］，與本研究的結果一致，在宮頸癌組織中，CAⅨ的表達水平與淋巴結轉移存在相關性（P=0.024），伴有淋巴結轉移的組織中，CAⅨ的表達明顯升高（P=0.001）。GUO 等［15］研究發現，CD8+TIL 存在不同的亞型，因分布和功能的不同，影響患者的預后。本研究分析了癌巢及間質CD8+TIL的數量，結果顯示：宮頸癌組織中，癌巢CD8+T 細胞的浸潤數量隨淋巴結轉移顯著減少（P＜0.001），提示癌巢CD8+TIL 可能與宮頸癌淋巴結轉移相關，這與GORTER［16］等人的研究結果相符合。同時發現，CAⅨ高表達的組織，癌巢CD8+TIL 數量減少，間質CD8+TIL數量增多。既往多項研究表明，缺氧腫瘤微環境發生代謝變化，如癌細胞釋放乳酸，腺苷等引起的酸中毒，嚴重損害細胞毒性T 細胞的功能和增殖［17］。在肺腺癌中，LI［18］團隊證實，缺氧腫瘤微環境抑制CD8+TIL的募集及浸潤，結合本課題的發現，推測腫瘤微環境中，缺氧可能參與CD8+TIL的調控。

綜上，推斷CAⅨ和癌巢CD8+TIL 在宮頸癌淋巴結轉移中可能發揮相互制約作用。目前，國內外關于缺氧聯同CD8+TIL 的研究鮮少，但有研究證實，腫瘤組織中，相較于單一因素的檢測，PDL1 聯合CD8+TIL 的檢測成為患者預后評估更有利因素［19］。因此本研究構建宮頸癌淋巴結轉移聯合診斷模型，結果顯示，CAⅨ聯合癌巢CD8+TIL 在預測淋巴結轉移中，具有最高的診斷效能，其中特異度、陽性預測值為100%，理論上可避免淋巴結轉移的誤診，在一定意義上增強了臨床醫生診斷淋巴結轉移的信心，同時為臨床個體化治療方案的選擇提供了理論依據。

本研究作為回顧性研究，仍需通過大規模的臨床研究進行驗證。同時本研究缺乏患者術后隨訪資料的統計，不能評估兩者的檢測對患者預后價值的預測效能。后期研究將加強患者的術后隨訪，完善生存數據的分析。

綜上所述，宮頸癌組織中，缺氧和癌巢CD8+TIL的表達與淋巴結轉移密切相關，二者相互制約，聯合檢測可作為術前淋巴結轉移的預測因素。鑒于在宮頸癌組織中，缺氧可能參與CD8+TIL 的調控，影響腫瘤免疫微環境，促進淋巴結轉移，研究重點可靶向二者作用的具體機制，為宮頸癌的治療開發新靶點，這也將是本課題今后的研究方向。