電針聯合重復經顱磁刺激對D-半乳糖誘導的阿爾茨海默病樣模型大鼠學習記憶能力及神經炎癥的影響

陳虹茹 何川 黃重生 王穎 孔立紅

1湖北中藥大學針灸骨傷學院（武漢430061）；2武漢市中心醫院（武漢430015）

隨著老齡化的逐年劇增，老年性癡呆患者數量大幅度上升，嚴重影響個人及其家人的心理健康及生活質量，并增加患者家庭和社會經濟負擔［1］。阿爾茲海默病（Alzheimer′s disease，AD）又稱作老年性癡呆，是一種腦組織慢性退行性損傷引起的神經性疾病，以認知和生活行為功能障礙為突出表現［2］。

大量研究證明AD 患者腦組織隨著年齡增長持續增強的炎癥反應在疾病的病理過程中起著關鍵作用［3］。目前臨床上治療AD 的西藥主要以膽堿酶抑制劑和氨基酸受體拮抗劑。然而這些藥物有一定的局限性，長期服用費用高、患者依從性差，并且具有嚴重的不良反應［4］。因此，積極尋求安全有效的非藥物治療方法尤為重要。已有大量研究運用電針來防治AD，并證明其可抑制腦組織毒性炎癥反應，可以有效提高學習記憶功能［5］。近幾年出現的新型神經電生理技術-重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS），在神經系統疾病領域備受關注［6］。它通過將電流持續重復作用于大腦遠隔皮層，影響皮層支配區域神經遞質與突觸傳遞，改變神經元興奮性，促進神經元突觸修復和功能重組［7］。但國內將電針聯合rTMS 防治AD 的研究尚在摸索階段，因此本研究利用行為學等檢測方法來進一步深入探討EA聯合rTMS 對改善AD 樣模型大鼠認知功能障礙的可能機制和療效。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物分組4個月齡SD雄性大鼠，體質量370 ～390 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2018-0018。飼養環境通風，光照均勻，自由飲食。大鼠適應性飼養1 周后，采取隨機數字表法將大鼠分成正常組（Normal）、模型組（Model）、電針組（EA）、重復經顱磁組（rTMS）和電針＋經顱磁組（EA+rTMS），每組8 只。

1.1.2 主要實驗儀器和試劑HANS-200A 韓式電針儀（南京濟生醫療科技有限公司），一次性無菌毫針（北京中研太和醫療器械有限公司），Morris 水迷宮（成都泰盟），石蠟切片機（廣州三元科技有限公司），電泳儀（北京市六一儀器廠，型號：DYY-6C），HT7700 透射電鏡（日本日立公司），重復經顱磁刺激儀（YRD CCY-1 型，武漢依瑞德公司）。Iba-1 一抗、山羊抗兔IgG H&L（Cy3?）、預吸附二抗（英國Abcam），TNF-α、IL-6、IL-1β抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及干預方法除正常組外，其他組均采用D-半乳糖［120 mg/（kg·d）］腹腔連續注射8 周制備AD 樣模型大鼠［8］。造模結束后進行干預，方法如下：（1）EA 組：根據余曙光《實驗針灸學》［9］取動物針灸常用“百會”和兩側“腎俞”穴。0.25 mm × 15 mm 毫針向前15°角平刺“百會”3 ～4 mm，“腎俞”向脊柱方向斜刺3 ～4 mm，一組導線分別接“百會”和“腎俞”，左右“腎俞”穴隔日交替使用。予連續波，頻率50 Hz，電流1 mA，以針刺局部顫動即可。（2）rTMS 組：采用YRD CCY-1型電磁刺激儀，固定大鼠頭部，將“8”字線圈垂直緊貼大鼠顱部左側前額葉，刺激頻率為5 Hz，最大輸出強度為90%，重復脈沖磁刺激10 串，每串10 次。（3）EA＋rTMS 組：電針治療之后進行重復經顱磁刺激，方法及刺激參數同EA 組和rTMS 組，以上干預1 次/日，共2 周。

1.2.2 Morris 水迷宮實驗水池直徑120 cm，高60 cm。平臺置于第4 象限，池中裝水直至水面高出平臺2 cm，水溫保持在（23.0±0.5）℃。兌入奶粉攪拌，使整個背景與大鼠頭部涂有黃色苦味酸的毛發形成反差，在水池每個象限邊緣中點貼上標簽作為入水點。定位航行試驗：實驗前將大鼠放入水池自由游泳2 min 以適應水池環境。將大鼠面向池壁從4 個入水點依次放入水中，記錄其在120 s 內找到平臺的時間（即逃避潛伏期）和游泳路徑。若大鼠在120 s 內未能找到平臺則牽引至平臺停留10 s，記錄其逃避潛伏期為120 s，連續實驗5 d。空間探索實驗：第6 天移去平臺，將大鼠從原平臺的對側象限入水點投放水中，自由游泳120 s，記錄各組大鼠在原平臺象限探索時間。

1.2.3 透射電鏡觀察大鼠海馬區突觸后致密帶厚度行為學測試結束后每組選4 只大鼠，稱重按量，腹腔注射水合氯醛進行麻醉，置冰上快速剝離出新鮮海馬組織，迅速轉入現配的電鏡固定液中，4 ℃固定2～3 h。3 d 后0.01 MPBS 漂洗組織，1%鋨酸固定1 h，漂洗后在不同濃度乙醇里進行梯度脫水，隨后丙酮液中浸透，環氧樹脂包埋劑中35 ℃過夜，最后聚合、切片和染色，透射電鏡觀察及拍片，用Image-pro plus 6.0 軟件來計算突觸后致密帶厚度。

1.2.4 免疫組織化學染色法檢測大鼠海馬區活化的小膠質細胞數量每組取4 只大鼠將其麻醉，心臟灌注固定后斷頭取腦，置固定液中24 h。隨后滴蠟包埋、切片。組織常規脫臘清洗，檸檬酸緩沖液進行抗原修復，冷卻后PBS 清洗3 次，H2O2室溫孵育以滅活內源性過氧化物酶。PBS 沖洗，滴加山羊血清封閉，再滴加Iba-1 一抗（1∶100），濕盒內4 ℃過夜，PBS 清洗3 次；滴山羊抗兔IgG H&L（Cy3?）預吸附二抗，濕盒避光孵育1 h，PBS 沖洗3次；然后滴辣根酶室溫孵育，加入現配DAB 顯色液，染至棕黃色，PBS 沖洗后滴加蘇木素染色60 s，隨后1%HCL 分化10 s，脫水，風干，封片。顯微鏡下觀察統計激活的小膠質細胞數。

1.2.5 Western blot 法檢測大鼠海馬組織TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達水平大鼠快速斷頭，解剖分離出海馬，配置凝膠加入樣品蛋白，進行組織樣品蛋白提取；現配RIPA 裂解液，PBS 漂洗，加裂解液進行高速離心勻漿；取上清液測定蛋白濃度，根據PAGE 凝膠電泳分離出目標條帶，采用濕轉法進行轉膜，在TBST 中封閉滴加一抗，4 ℃孵育過夜清洗再滴二抗，室溫避光孵育2 h，經ECL 化學發光法檢測蛋白條帶。收集圖像，使用AlPhaEaseFC軟件對樣品條帶的吸光度值進行數字化分析，以β-actin 為參照蛋白，目的蛋白與β-actin 的比值則為其相對表達量。

1.3 統計學方法采用GraPhPad Prism.8 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，對符合正態分布的數據，組間比較用方差分析，組間多重比較方差齊時采用t檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗（Kruskal-Wallis）。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris 水迷宮實驗在定位航行實驗第1 天各組間逃避潛伏期無差異；第2 天模型組與正常組與EA+rTMS 組比，逃避潛伏期延長（P＜0.01）；此后3 d 各干預組逃避潛伏期隨著訓練的延長比模型組明顯縮短（P＜0.01），表明各組大鼠在持續學習訓練中已逐漸通過學習記憶找到平臺。空間探索實驗中模型組比其余組在目標象限探索時間明顯縮短（P＜0.01）；EA + rTMS 組比EA 組和rTMS 組在目標象限探索時間又顯著延長（P＜0.01）。說明EA 和rTMS 刺激干預都能改善大鼠空間學習記憶能力，EA 聯合rTMS 刺激治療比單獨使用EA 或rTMS 刺激療效更顯著。見圖1、2。

圖1 各組大鼠逃避潛伏期比較Fig.1 Comparison of escape latency of rats ineachgroup

圖2 各組大鼠在目標象限探索時間比較Fig.2 Comparison of exploration time in the target quadrant of rats in each group

2.2 各組大鼠海馬區突觸后致密帶厚度比較與正常組比較，模型組大鼠海馬區突觸后致密帶稀薄（P＜0.01），前后膜界限不清；與模型組比較，各干預組大鼠突觸后致密帶厚度增大（P＜0.01）；與EA+rTMS 組比，EA 組和rTMS 組大鼠突觸后致密帶厚度更顯著變薄（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬區突觸后致密帶厚度比較Fig.3 Comparison of the thickness of the postsynaptic dense zone in the hippocampus of rats in each group

2.3 各組大鼠海馬區活化的小膠質細胞數比較與正常組比較，模型組小膠質細胞胞核增大，偽足增長，數量增多（P＜0.01）；與模型組比較，各干預組活化的小膠質細胞數明顯下降（P＜0.01）；與EA + rTMS 組比較，EA 組和rTMS 組活化的小膠質細胞數增加（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬區活化的小膠質細胞數比較Fig.4 Comparison of the number of the activatedmicrogliacells in hippocampus of rats in each group

2.4 各組大鼠海馬區TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達比較與正常組比較，模型組大鼠海馬區TNF-α、IL-6、IL-1β的表達增強，與模型組比較，各干預組蛋白表達差異均有統計學意義（P＜0.01）；與EA+rTMS 組比較，EA 組和rTMS 組海馬區各蛋白表達均上升（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組大鼠海馬區炎癥相關蛋白表達量比較Fig.5 Comparison of the expression levels of inflammation-related proteins in hippocampus of rats in each group

3 討論

AD 的病理發展過程復雜多變，至今認為腦組織中大量神經元損傷和突觸丟失是AD 的典型病理特征［10］。人類大腦主要由神經元和膠質細胞兩類細胞組成。神經元是神經回路形成的基本單位，它由軸突、樹突以及突觸構成。神經突觸是神經元之間信息傳遞形成回路的核心部件，也是產生認知記憶的基本［11］。突觸由突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜構成，PSD 是突觸后膜內側胞質面一層致密物質，它參與突觸后膜信息的重組與編輯，影響突觸結構的可塑性，對學習記憶功能有重要作用［12］。膠質細胞中小膠質細胞（microgia，MG）介導的神經炎癥反應是導致神經元損傷和突觸丟失的關鍵［13］。MG 是中樞神經系統主要的防御細胞，但在AD 進程中持續激活的MG 對突觸過度吞噬清除，造成突觸喪失及認知功能下降［14］。有研究結果顯示電針和rTMS 可改變動物MG 的激活，提高突觸重組和傳遞效能，保護神經元［15-16］。本研究也顯示EA 和rTMS 有保護神經元的作用，但EA 與rTMS 聯合比單一的治療方法更加有效地抑制MG 的激活，增大PSD 厚度，使神經突觸之間緊密連接，極大地提高了AD 樣模型大鼠逃避潛伏期和在目標象限探索時間，是控制大鼠學習記憶能力損害的可行手段。

同時持續激活的MG 釋放大量的促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β［17-18］等，促進APP 形成和Aβ沉積，誘導Aβ斑塊周圍的神經元丟失及凋亡，加重炎癥反應［19］。本研究顯示EA 結合rTMS 比單獨的EA 組和rTMS 組顯著地減少炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放。

綜上所述，EA 結合rTMS 或許是通過抑制AD樣模型大鼠腦內神經炎癥反應，降低對突觸的損害從而提升大鼠空間學習記憶和認知能力。但是本研究中對大鼠突觸的改變是激活的MG 引起的還是炎癥因子引起的，還是兩者皆有，有待進一步研究。