巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1ɑ拮抗劑聯(lián)合硼替佐米通過抑制Erk1/2/Bax促進(jìn)骨髓瘤骨病成骨的作用

陳衛(wèi)瓊 蔣芳 王姍姍 黃勃 屈付君 黃林 王曉桃

桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（廣西桂林541100）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種B 細(xì)胞惡性腫瘤，溶骨性破壞是其主要表現(xiàn)之一［1］。骨髓瘤骨病（myeloma bone disease，MBD）的發(fā)生機(jī)制是破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）活性增加，成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）活性受抑制，導(dǎo)致骨吸收和骨形成平衡失調(diào)［2］。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α（macrophage inflammatory protein 1-α，MIP-1α）、白介素（interleukin，IL）-6 和骨硬化蛋白（sclerostin，SOST）等在內(nèi)的多種破骨細(xì)胞活化因子影響OC 分化［3-5］。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)MIP-1α與MBD關(guān)系密切，目前MIP-1α在MBD 發(fā)生中的作用，主要集中在OC 的激活［3］。研究發(fā)現(xiàn)，MIP-1α也有抑制OB 的作用，但其抑制OB 的特點(diǎn)不明確［3，5］。有文獻(xiàn)報(bào)道，骨髓瘤中瘤細(xì)胞分泌的MIP-1α可促使G 蛋白R(shí)as 和Rho 異戊稀化，從而導(dǎo)致MM 患者骨髓中的Rho 亞家族蛋白A（Ras homologueA，RhoA）水平增高，RhoA 與其下游的效應(yīng)蛋白R(shí)ho 相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho-associated coild-protein kinas，ROCK1）相互作用參與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)錄活性［6-8］，且前期研究發(fā)現(xiàn)在MM 患者中RhoA/ROCK1 高表達(dá)［9］。活化的RhoA/ROCK1 可以激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，Erk），而Erkl/2 與其有同源結(jié)構(gòu)域，Erkl/2 的作用底物是Bax，Erkl/2 活化后上調(diào)Bax，啟動(dòng)凋亡信號(hào)通路，最終引起OB 凋亡［3］。目前國內(nèi)外針對(duì)MIP-1α是否通過Erk1/2/Bax 影響成骨作用未見相關(guān)報(bào)道。

硼替佐米（bortezomib，Bor）在臨床上常用于MBD 患者［10］。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，Bor 可通過APRIL-NFkB 通路抑制MIP-1α［11］。基于此，本研究通過構(gòu)建MBD 小鼠模型，在給予MIP-1α拮抗劑干預(yù)后，檢測小鼠骨質(zhì)破壞嚴(yán)重程度并評(píng)估OB 和OC 功能狀態(tài)及相關(guān)蛋白表達(dá)，以此來探討MIP-1α拮抗劑聯(lián)合Bor 是否抑制Erk1/2/Bax 通路影響MBD 成骨作用及MIP-1α拮抗劑與Bor 聯(lián)合治療是否具有協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料RPMI1640 培養(yǎng)（美國Gibco 公司）；胎牛血清（美國Gemini 公司）；裂解液（北京索來寶公司）；PVDF 膜（Millipore 公司）；ECL 發(fā)光試劑盒、山羊抗兔的二抗、山羊抗鼠的二抗、β-actin（北京中杉）；一抗：ERK、BAX、Caspase-3、Caspase-9（ABCAM）；ELISA 試劑盒：sRANKL、BALP、OPG、SOST、MIP-1α、IL-6（CUSABIO）；CD138+抗體、免疫組化抗原修復(fù)緩沖液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；硼替佐米、Bx471（美國MCE 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)MM IM-9 細(xì)胞株培養(yǎng)于含青霉素與鏈霉素組成的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，每3～4 天傳代。

1.2.2 MBD 小鼠局部成瘤模型選擇4 ～6 周齡的SCID 小鼠，在上肢接種絕對(duì)數(shù)1×106個(gè)（100 μL瘤細(xì)胞懸液）的IM-9 細(xì)胞，當(dāng)皮下移植瘤生長到直徑約15 ～30 mm 時(shí)，HE 染色和免疫組化鑒定惡性漿細(xì)胞建模成功后，將成瘤小鼠按腹腔給藥分為四組：對(duì)照組（0.9%生理鹽水）、Bor 組（Bor 0.5 mg/kg，1、4、8、11 d 共4 次）、Bx471 組（BX471 2 mg/kg，每周2 次，共4 次）、Bor 聯(lián)合Bx471 組（Bor 及Bx471，劑量及用法同上）［12-13］。

1.2.3 X 線檢測各組骨損情況給藥結(jié)束后4 d，收集靜脈血，處死各組小鼠，俯臥位將小鼠固定，用X 線（型號(hào)：FLAT-BYM）檢測骨質(zhì)破壞情況。

1.2.4 小鼠中RANKL、OPG、BALP、MIP-1α、SOST、IL-6 蛋白及因子含量的測定將上述靜脈血15 000 rpm/15 min 低溫離心，取上清液備用。分離各組上肢瘤組織，沖洗剪碎，將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（按1∶9 的重量體積比）加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨及混勻，最后將勻漿液12 000 rpm/10 min，取上清備用。具體按照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.2.5 Western blot 檢測信 號(hào) 通路Erkl/2、Bax、Caspase 3、Caspase 9 蛋白質(zhì)的表達(dá)取上述瘤組織上清液，采用BCA 測蛋白濃度。在10%SDSPAGE凝膠上分離等量的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，封閉后的膜直接放入相應(yīng)一抗工作液中，孵育，洗膜，將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中，孵育，洗膜。曝光及洗片，以β-actin 表達(dá)量作為內(nèi)參，用Image J 軟件（版本號(hào)1.4.3.67，Tanon 公司）測定條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布，比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果

2.1 MBD 小鼠病理學(xué)及各組骨質(zhì)破壞影像學(xué)特征與正常小鼠（圖1A）相比，成瘤小鼠右上肢出現(xiàn)局部腫大（圖1C）。正常小鼠組織HE 染色切片未見異型細(xì)胞，CD138+免疫組化特異染色未見漿細(xì)胞（圖1B）。成瘤小鼠皮下瘤組織HE 染色：顯微鏡下可見多處細(xì)胞質(zhì)增大，細(xì)胞核偏位排列彌漫密集的異性細(xì)胞；CD138+免疫組化特異染色可見多處細(xì)胞棕染，鑒定為克隆性漿細(xì)胞（圖1D）。X 線顯示，成瘤小鼠（對(duì)照組）右上肢出現(xiàn)病理性骨折（圖2B），骨質(zhì)破壞程度高于正常小鼠（圖2A），經(jīng)Bor（圖2C）、Bx471（圖2D）及雙藥（圖2E）聯(lián)合治療小鼠骨質(zhì)破壞程度低于對(duì)照組。

圖1 MBD 小鼠病理學(xué)檢測Fig.1 Pathological detection of MBD mice

圖2 MBD 小鼠骨質(zhì)破壞影像學(xué)特征Fig.2 Imaging features of bone destruction in MBD mice

2.2 MIP-1α拮抗劑聯(lián)合硼替佐米可抑制破骨作用而促進(jìn)成骨作用結(jié)果顯示，對(duì)照組的MIP-1α、SOST、RANKL、IL-6 水平高于Bor 及Bx471 組（P＜0.05），且明顯高于Bor+Bx471 組（P＜0.000 5），而OPG、BALP 的表達(dá)明顯低于Bor+Bx471 組（P＜0.000 5）。見表1、圖3。

圖3 各組小鼠中MIP-1α、SOST、IL-6、BALP、RANK、OPG 蛋白表達(dá)水平Fig.3 Relative expression levels of MIP-1α，SOST，IL-6，BALP，RANK and OPG in each group of mice

表1 不同組別中MIP-1α、SOST、IL-6、BALP、RANK、OPG 因子及蛋白表達(dá)水平Tab.1 Relative expression of factors and protein expression levels of MIP-1α，SOST，IL-6，BALP，RANK and OPG in different groups ±s

表1 不同組別中MIP-1α、SOST、IL-6、BALP、RANK、OPG 因子及蛋白表達(dá)水平Tab.1 Relative expression of factors and protein expression levels of MIP-1α，SOST，IL-6，BALP，RANK and OPG in different groups ±s

組別Control Bor Bx471 Bor+Bx471 MIP-1（ng/mL）239.9±44.2 169.9±24.7 184.1±23.7 131.2±22.4 IL-6（ng/mL）43.2±6.4 25.6±4.9 29.2±3.8 21.5±3.1 BALP（ng/mL）22.8±8.0 40.1±9.5 39.0±8.0 50.7±6.1 SOST（pg/mL）1 063.6±81.6 511.2±73.2 726.5±119.6 420.1±93.6 RANK（ng/mL）1 601.7±266.7 1 002.2±189.7 999.2±114.1 764.0±182.5 OPG（ng/mL）387.4±154.2 586.7±134.5 550.2±113.7 833.7±146.5

2.3 MIP-1α拮抗劑聯(lián)合硼替佐米抑制Erkl/2、Bax、Caspase 3、Caspase 9 蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)果顯示，對(duì)照組的Erkl/2、Bax、Caspase 3、Caspase 9 蛋白表達(dá)高于Bor 組及Bx471 組（P＜0.001），且明顯高于Bor+Bx471 組（P＜0.001）。見圖4。

圖4 各組小鼠中Erkl/2、Bax、Caspase 3、Caspase 9 蛋白表達(dá)水平Fig.4 Protein expression levels of Erkl/2，Bax，Caspase 3，Caspase 9 in each group of mice

3 討論

了解骨髓微環(huán)境中細(xì)胞相互作用對(duì)于開發(fā)針對(duì)骨髓瘤細(xì)胞靶向治療和調(diào)節(jié)MBD 骨穩(wěn)態(tài)的新型藥物至關(guān)重要［1］。本實(shí)驗(yàn)通過抑制MIP-1α產(chǎn)生后，上調(diào)OPG 表達(dá)，下調(diào)RANKL 表達(dá)，X 線顯示骨密度增加，同時(shí)腫瘤負(fù)荷IL-6 表達(dá)減少。其機(jī)制可能是MIP-1α抑制劑通過抑制某種破骨細(xì)胞信號(hào)通路，下調(diào)的RANKL/OPG 比例，從而阻斷破骨細(xì)胞活化及增殖，從而重建骨代謝平衡。在MM 患者的骨髓活檢中發(fā)現(xiàn)OB 是受抑制的，并且與腫瘤負(fù)荷相關(guān)［5］。據(jù)報(bào)道，瘤細(xì)胞超過50%，可抑制OB活性［6］。因此，MIP-1α拮抗劑可能通過減少腫瘤負(fù)荷，增強(qiáng)OB 活性［14］。

持續(xù)抑制Erk 信號(hào)傳導(dǎo)可促進(jìn)OB 的發(fā)展［15-16］。本研究通過抑制MIP-1α產(chǎn)生，Erk1/2、Bax 表達(dá)下降，骨質(zhì)破壞程度改善，可能MIP-1α拮抗劑抑制Erk1/2/Bax 通路促進(jìn)OB 增殖。MIP-1α主要被認(rèn)為是破骨細(xì)胞活化因子，在骨骼疾病的發(fā)病機(jī)理中促進(jìn)分解代謝活性［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了MIP-1α的新作用，它可能是OB 功能的抑制劑和MM 中OB/OC 解偶聯(lián)的介質(zhì)。同時(shí)，經(jīng)Bor 治療后的小鼠結(jié)果與MIP-1α拮抗劑（Bx471）組大致相同，且雙藥聯(lián)合效果更為顯著。其可能通過抑制NF-κB 信號(hào)通路，下調(diào)RANKL/OPG 比例，阻礙破骨細(xì)胞活化，重建骨質(zhì)代謝平衡。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)硼替佐米可通過APRIL-NF-KB 通路抑制MIP-1α表達(dá)［11］。因此，Bor 可能通過APRIL-NF-KB 信號(hào)通路抑制MIP-1ɑ，從而抑制Erk1/2/Bax 通路，促進(jìn)OB 增殖。結(jié)論有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過抑制MIP-1α產(chǎn)生，SOST 表達(dá)下降。研究發(fā)現(xiàn)大部分MBD 患者骨髓的SOST水平與骨質(zhì)破壞程度相關(guān)，同時(shí)SOST 與MIP-1α呈正相關(guān)［3］。此外，在新診斷MM 患者中發(fā)現(xiàn)由SOST 基因編碼的骨硬化蛋白的高水平表達(dá)，且與晚期MM 具有相關(guān)性［18］。推測可能在晚期MBD 患者中，MIP-1α刺激瘤細(xì)胞高表達(dá)SOST，兩者相互作用，促進(jìn)OB凋亡［19-20］。除此之外，經(jīng)Bor治療后，SOST 下降，這可能是由于Bor 的抗骨髓瘤作用。Bor 下調(diào)SOST 的表達(dá)揭示了Bor 在逆轉(zhuǎn)骨髓瘤OB功能中的另一種作用機(jī)制［21］。

綜上，MIP-1α拮抗劑聯(lián)合Bor 可能通過抑制Erkl/2/Bax/Caspase-3/Caspase-9 通路，從而促進(jìn)OB增殖及抑制OC 分化，雙藥聯(lián)合治療對(duì)于MBD 成骨作用效果可能更為顯著。本實(shí)驗(yàn)尚有不足之處，研究所采用的局部成瘤造模方式不能完全模擬MBD 的骨髓微環(huán)境和從MM 發(fā)展到MBD 的生理病理機(jī)制過程。然而，本次實(shí)驗(yàn)將MIP-1α從MBD 復(fù)雜的骨髓微環(huán)境中抽離出來單獨(dú)分析其導(dǎo)致骨質(zhì)破壞的原因，可以避免其他因子和通路對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。但仍需在體外細(xì)胞進(jìn)行下一步驗(yàn)證。