灰霉病菌對4種常用殺菌劑的抗藥性監(jiān)測

周明洋

(南京市高淳區(qū)固城街道農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心,江蘇 南京 211300)

1.前言

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的一種全球范圍的真菌病害。灰葡萄孢可以侵染235種蔬菜、果樹以及其他經(jīng)濟(jì)作物（李保聚，1998），一旦發(fā)病就會引起大量減產(chǎn)，甚至絕收，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大危害(陳鳳平等，2010)。灰葡萄孢的菌核可直接萌發(fā)產(chǎn)生菌絲體、分生孢子梗及分生孢子，分生孢子成熟后脫落，借氣流、雨水或露珠及農(nóng)事操作進(jìn)行傳播（李保聚等，1998）。在18~23℃和相對濕度持續(xù)90%以上的多濕、弱光條件下，農(nóng)作物最易發(fā)病；溫度低于15℃或高于25℃時，則發(fā)病明顯減輕；溫度高于30℃時，基本不發(fā)病。另外，在田間分生孢子可多次再侵染（Meyer，2008）。

灰霉病的防治一直是個重要問題，目前生產(chǎn)上主要通過物理防治、化學(xué)防治和生物防治等幾種方法，其中最有效的方法為化學(xué)防治（張彩鳳等，2013）。化學(xué)防治常用藥劑主要有苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、氨基甲酸酯類和抗菌素類四大類。而由于灰霉病菌具有繁殖速度快、遺傳變異大和適合度高等特點，連續(xù)長期使用單一藥劑容易產(chǎn)生抗藥性。目前，灰葡萄孢已對苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、氨基甲酸酯類等藥劑產(chǎn)生抗藥性。其抗藥性機(jī)理主要為毒劑滲透性減弱、脫毒作用增強(qiáng)與毒性代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)換作用的減弱、靶標(biāo)位點敏感性降低等（于永學(xué)等，2009）。由于灰霉病菌抗藥性在生產(chǎn)上造成了一系列問題，因此，我們需要通過進(jìn)一步的研究來深入了解灰霉病菌的抗藥性。為明確不同地區(qū)不同作物上灰霉病菌的抗藥性情況，本研究主要對采自蘇州、南通、揚州、上海、嘉善、寧波等地的番茄、萵苣、草莓、瓠瓜、西瓜、黃瓜等不同作物上的153種灰霉菌菌株的抗藥性進(jìn)行了檢測。

2.材料與方法

2.1 菌株的采集

2020 年，在蘇州、揚州、南通、上海和浙江等地的塑料大棚內(nèi)，采集番茄、萵苣、草莓、黃瓜、瓠瓜和西瓜等灰霉病病株，共分離得灰霉菌株153個（表1）。

表1 分離自不同地區(qū)的灰霉菌株

2.2 供試藥劑

多菌靈：95% 多菌靈原藥；速克靈：98% 速克靈原藥；

嘧霉胺：98% 嘧霉胺原藥；咯菌腈：97.1% 咯菌腈原藥。

2.3 培養(yǎng)基

PDA：馬鈴薯洗凈去皮，稱取200g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，用八層紗布過濾。繼續(xù)加熱，再加入15～20g瓊脂，攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入10 g葡萄糖。攪拌均勻，稍冷卻后再加水定容至1000mL。分裝于錐形瓶中，加塞、包扎，121℃，滅菌20 min后取出，冷卻后貯藏備用。

LSP：10 g Glucose，1.5 g K2HPO4，2.0 g KH2PO4，1g(NH4)2SO4，0.5 g MgSO4?7H2O，16 g Agar，1000 ml H2O。

2.4 含藥平板的制備

95%多菌靈原藥用0.1 mol/L HCL水溶液配制成1000 μg/mL 母液；98%速克靈原藥用丙酮配置成10000 μg/mL 母液；98%嘧霉胺原藥用甲醇配制成1000 μg/mL 母液；97.1% 的咯菌腈原藥用甲醇配制成1000 μg/mL 母液。各母液在4 ℃冰箱內(nèi)貯藏，使用時將多菌靈、速克靈和咯菌腈分別配制成1μg/mL、5μg/mL和0.5μg/mL 的含藥PDA平板；將嘧霉胺配制成1μg/mL 的含藥LSP平板，然后用以進(jìn)行抗藥性測定。

2.5 抗藥性監(jiān)測

采用區(qū)分劑量法。將在1μg/mL多菌靈含藥平板、5μg/mL速克靈、0.5μg/mL咯菌腈和1μg/mL的嘧霉胺含藥平板上不能正常生長的菌株定義為敏感菌株，能在平板上生長的菌株定義為抗性菌株。將待測菌株在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)96 h 后，將帶菌平板切成小塊，然后用接種針將其接于含藥平板上。25 ℃黑暗培養(yǎng)72 h 后，觀察菌絲生長情況，統(tǒng)計各地區(qū)敏感和抗性菌株的頻率，每處理重復(fù)3次。

抗性頻率(%)=(抗性菌株數(shù)／測定總菌株數(shù))×100%。

3.結(jié)果與分析

3.1 不同地區(qū)來源灰霉病菌對幾種藥劑的抗性頻率

由表2可知，供試的153個菌株中，對嘧霉胺表現(xiàn)抗性的菌株有98個，占總數(shù)的64.05%。可以看出，在揚州和南通地區(qū)，灰霉病菌對嘧霉胺的抗性頻率在50%以下，而其它地區(qū)抗性頻率均較高，特別是在上海地區(qū)，高達(dá)97.61%。因此，在上海、嘉善等地區(qū)，嘧霉胺已不再適宜用于蔬菜灰霉病的防治。

表2 不同地區(qū)來源菌株對嘧霉胺的抗性頻率

平均 98 153 64.05

由表3可知，供試153個菌株中，對多菌靈表現(xiàn)抗性的菌株有104個，抗性頻率為67.97%。可以看出，灰霉病菌對多菌靈的抗性頻率均較高，但揚州地區(qū)僅為8.33%，說明多菌靈在揚州地區(qū)仍可作為防治蔬菜灰霉病的主要藥劑。

表3 不同地區(qū)來源菌株對多菌靈的抗性頻率

由表4可知，供試153個菌株中，對速克靈表現(xiàn)抗性的菌株有98個，抗性頻率為64.05%。可以看出，在揚州和南通地區(qū)，灰霉病菌對速克靈的抗性頻率在50%以下，而其它地區(qū)抗性頻率均較高，特別是在上海地區(qū)，高達(dá)95.23%。因此，在上海、嘉善等地區(qū)，速克靈已不再適宜用于蔬菜灰霉病的防治。

表4 不同地區(qū)來源菌株對速克靈的抗性頻率

由表5可知，所有供試的153個菌株均對咯菌腈敏感，未能檢測到抗性菌株，因此，咯菌腈可認(rèn)為是目前生產(chǎn)上各地防治灰霉病的首選藥劑。

表5 不同地區(qū)來源菌株對咯菌腈的抗性頻率

3.2 不同寄主來源灰霉病菌對幾種藥劑的抗性頻率

由表6可知，供試153個菌株中，對嘧霉胺表現(xiàn)抗性的菌株有98個，抗性頻率為64.05%。可以看出，來源于西瓜和萵苣的灰霉病菌對嘧霉胺的抗性頻率較低，而其它來源菌株抗性頻率較高，特別是源自瓠瓜和黃瓜的灰霉菌株全部對嘧霉胺表現(xiàn)抗性，這可能是因為在西瓜和萵苣上嘧霉胺使用較少，而在瓠瓜和黃瓜上施用較多的緣故。

表6 不同寄主來源菌株對嘧霉胺的抗性頻率

由表7可知，供試153個菌株中，對多菌靈表現(xiàn)抗性的菌株有104個，抗性頻率為67.97%。可以看出，來源于西瓜和萵苣的灰霉病菌對多菌靈的抗性頻率為0，而其他來源菌株抗性頻率較高，特別是源自瓠瓜和黃瓜的灰霉菌株全部對多菌靈表現(xiàn)抗性，這可能是因為在西瓜和萵苣上多菌靈使用較少，而在瓠瓜和黃瓜上施用較多的緣故。

表7 不同寄主來源菌株對多菌靈的抗性頻率

由表8可知，供試153個菌株中，對速克靈表現(xiàn)抗性的菌株有98個，抗性頻率為64.05%。可以看出，來源于西瓜和萵苣的灰霉病菌對速克靈的抗性頻率為0，而其他來源菌株抗性頻率較高，特別是源自瓠瓜和黃瓜的灰霉菌株全部對速克靈表現(xiàn)抗性，這可能是因為在西瓜和萵苣上多菌靈使用較少，而在瓠瓜和黃瓜上施用較多的緣故。

表8 不同寄主來源菌株對速克靈的抗性頻率

黃瓜 3 3 100平均 98 153 64.05

由表9可知，所有供試的153個菌株均對咯菌腈敏感，未能檢測到抗性菌株，因此，咯菌腈可認(rèn)為是目前蔬菜生產(chǎn)上防治灰霉病的首選藥劑。

表9 不同寄主來源菌株對咯菌腈的抗性頻率

4.討論

長期以來，灰霉菌對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了極其重大的危害，主要通過化學(xué)防治的方法進(jìn)行防治，主要使用的化學(xué)藥劑有苯胺基嘧啶類、苯并咪唑類、二甲酰亞胺類以及吡咯類等。但是，近年來國內(nèi)外均相繼報道了田間出現(xiàn)灰霉病菌對上述化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗性的菌株（王凌云等，2012）。本研究檢測了采自不同地區(qū)、不同寄主上的153種灰霉菌菌株對四種藥劑的抗藥性情況。

研究結(jié)果表明，灰霉病菌對嘧霉胺、多菌靈、速克靈抗藥性較為嚴(yán)重，均達(dá)到了60%以上，處于高抗水平；但咯菌腈對灰霉菌仍有較好的防治效果，這與之前國內(nèi)報道的灰霉菌對幾種藥劑的抗藥性情況基本相同（潘以樓等，2013）。采自不同地區(qū)以及不同寄主上的灰霉菌對上述幾種藥劑的抗性水平也有所不同，縱觀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所檢測的不同地區(qū)中，除揚州外，其他各地的灰霉菌對嘧霉胺、多菌靈、速克靈均產(chǎn)生了非常普遍的抗藥性；對與不同寄主來說，本研究采集樣本數(shù)量較多的番茄和草莓上的灰霉菌對上述藥劑也產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。分析原因可能是由于在某些地區(qū)及寄主上長期、單一使用上述藥劑造成的。

綜上所述，咯菌腈在防治灰霉病時可作為首選藥劑，減少嘧霉胺、多菌靈和速克靈的使用；不同地區(qū)應(yīng)對當(dāng)?shù)鼗颐共【顾幮赃M(jìn)行重點監(jiān)測，以指導(dǎo)科學(xué)用藥。在藥劑抗性嚴(yán)重地區(qū)或者抗性嚴(yán)重的寄主植物上停用該藥劑一段時間，或者減少該類藥劑的使用次數(shù)或使用量，盡量避免單劑使用；建議停止使用嘧霉胺、多菌靈或速克靈等高抗藥劑，或使之與不同作用機(jī)制的殺菌劑復(fù)配或者交替使用，推薦使用吡咯類殺菌劑，如咯菌腈，但使用時仍應(yīng)注意藥劑的用量，并注意與其他殺菌劑配合使用。