南芥菜花葉病毒衣殼蛋白的克隆、原核表達和多克隆抗體制備

蘇學思，張玉寶，王亞軍，郭志鴻，邱 陽，唐國亮

(1.中國科學院 西北生態環境資源研究院，蘭州 730000；2.中國科學院大學，北京 100049；3.甘肅省生態與農業綜合試驗野外科學觀測研究站，蘭州 730000)

南芥菜花葉病毒(Arabismosaicvirus，ArMV)屬于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)豇豆花葉病毒亞科(Comoviridae)線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)成員，是危害花卉、果樹、蔬菜等經濟作物的主要病原，是列入中國進境檢疫名錄的二類植物病毒[1]。ArMV病毒顆粒呈正二十面體結構，基因組由兩條正義單鏈RNA組成，編碼兩個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)[2]。ORF1由2 284個氨基酸多肽組成，編碼一個多聚蛋白，經蛋白酶剪切后共形成6個成熟的蛋白，分別為X1，X2，NTB，VPg，Pro，Pol[3]。ORF2包含有1 083個氨基酸多肽，也編碼一個多聚蛋白，剪切后形成病毒的歸巢蛋白(Homing protein，HP)、運動蛋白(Movement protein，MP)和衣殼蛋白(Coat protein，CP)[4]。

ArMV寄主廣泛，可以侵染約174屬215種植物，其中如煙草、草莓、葡萄、大豆、番茄等皆為中國廣泛種植的重要經濟作物[5]。ArMV所引起的病毒病癥狀主要表現為葉片花葉、斑駁、黃化，嚴重則表現為矮化、畸形、壞死等，顯著降低作物的產量和品質[6]。百合(Lilium)是一種集觀賞、食用和藥用價值于一體的重要經濟作物，近年來被發現是ArMV的新寄主[7-8]。百合感染ArMV后，除葉片和植株表現出上述癥狀外，種球部位還會出現壞死斑[9]。即便寄主相同，癥狀也會隨著株系、栽培品種、季節以及年份不同而發生變化。

為了有效控制ArMV的危害，并且制定出準確、高效的防治策略，迫切需要開發出快速高效的病毒檢測技術。血清學方法因為特異性強、靈敏度高、檢測速度快、大樣本檢測等優點，被作為田間最常用的病毒檢測方法[10]。然而提取病毒粒子為抗原的傳統方法，制備抗體存在著特異性差、效價低的問題[11]。近年來，運用分子生物學的方法，構建基因原核表達載體，誘導表達病毒蛋白，以此為抗原制備抗體的技術已經發展成熟，獲得的抗體具備很高的特異性和效價，被廣泛應用于植物病毒的抗體制備。

病毒基因組分析表明，ArMV無包膜蛋白(Envelope protein，ep)，其CP蛋白在維持病毒生存及病毒侵染寄主的過程中發揮著關鍵性作用[2]。目前，國內關于ArMV CP蛋白原核表達的研究，均是以部分CP基因為對象，在分析CP蛋白的結構和功能時存在不足[12-13]。因此，選擇克隆ArMV CP基因全長，誘導表達出具備完整結構和功能的CP蛋白，將為研究ArMV的致病機理奠定基礎。

本研究從感染ArMV的百合中克隆ArMV CP基因全長，構建ArMV CP基因的原核表達載體，轉化E.coliBL21(DE3)，經IPTG誘導表達，獲得大量高純度的ArMV CP蛋白，并以此為抗原制備高特異性的多克隆抗體，以期為ArMV的血清學檢測技術開發和致病機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

帶毒東方百合雜交品種‘木門’(‘Conca D’or’)葉片采自中國科學院西北生態環境資源研究院皋蘭生態與農業綜合試驗站(36°13″N，103°47″E)，經RT-PCR檢測[8,14]，獲得分別感染百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、百合斑駁病毒(Lilymottlevirus，LMoV)、車前草花葉病毒(Plantagoasiaticamosaicvirus，PlAMV)和ArMV的百合樣品，-70 ℃保存。

植物總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit)購自天根生化科技(北京)有限公司；植物蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；質粒微量抽提試劑盒(E.Z.N.A.○RPlasmid DNA Mini Kit Ⅰ)購自Omega公司；逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)、DNA回收試劑盒(Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit)和克隆載體pMDTM19-T購自寶生物工程(大連)有限公司；Ni-NTA預裝重力柱(Ni-NTA Pre-Packed Gravity Column)和NBT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑盒(藍色)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)菌株以及表達載體pET-28a(+)由甘肅省寒區旱區逆境生理與生態重點實驗室保存。

1.2 引物設計與合成

根據已經公布的百合ArMV CP基因序列(GenBank登錄號：KJ481187)設計合成特異性引物。為便于表達克隆化基因，分別在正向和反向引物上添加BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位點，引物序列如下(下劃線表示引入的酶切位點)：

正向引物：5′-GGATCCGGTCTTGCTGGTAGAGGTTCTG-3′

反向引物：5′-CTCGAGAACTTTAAAGCATGTTCTTCCGTA-3′

以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 ArMV CP基因的PCR擴增

使用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，以提取的總RNA為模板，按照試劑盒說明逆轉錄合成cDNAs，然后 PCR擴增ArMV CP基因。PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸80 s，循環擴增30次；72 ℃延伸7 min。擴增完畢，PCR產物經 15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段通過DNA回收試劑盒純化。

1.4 重組克隆載體的構建

純化片段連接T載體，轉化E.coliDH5α。用質粒微量抽提試劑盒提取質粒，PCR篩選陽性克隆。陽性質粒經BamH Ⅰ和XhoⅠ切割， 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，將酶切及凝膠電泳鑒定為陽性的質粒送交北京擎科新業生物技術有限公司測序，證實序列正確后命名為pMD19-T-ArMV。將測序獲得的CP序列提交GenBank，借助BLAST、ClustalW和DNAStar軟件進行序列比對、分析以及ArMV CP蛋白的抗原表位 預測。

1.5 重組原核表達載體的構建

pMD19-T-ArMV質粒和pET-28a(+)質粒經BamH Ⅰ和XhoⅠ切割，回收目的片段， 16 ℃連接過夜。連接產物轉化E.coliDH5α，涂布平板。挑取單克隆過夜培養，PCR篩選陽性克隆。提取質粒，經BamH Ⅰ和XhoⅠ切割，鑒定正確后命名為pET-28a-ArMV。未經酶切處理的重組質粒作為陰性對照。

1.6 ArMV CP蛋白的原核表達

陽性質粒pET-28a-ArMV轉化E.coliBL21(DE3)，接種至含有50 μg/mL Kana的LB液體培養基，37 ℃培養過夜。次日按1∶100接種于相同培養基，37 ℃培養至OD600達到0.7時添加1.0 mmol/L IPTG誘導，37 ℃振蕩培養，分別于3、4、5、6、7 h收集菌體進行SDS-PAGE電泳。未插入目的片段的空質粒誘導蛋白和未經IPTG誘導的重組菌蛋白作為陰性對照。

按相同的培養條件，誘導培養1 L菌體。菌體經0.01 mol/L PBS溶液懸浮、超聲破碎、離心后，取上清。按照Ni-NTA重力柱操作指南純化目的蛋白。

1.7 ArMV CP多克隆抗體的制備

用1 mg/mL 的ArMV CP純化蛋白作為免疫原免疫新西蘭大白兔。初次免疫中，將1 mg純化蛋白和完全弗氏佐劑等量混合均勻，進行皮下多點注射。兩周后進行增強免疫，將等體積的抗原和不完全弗氏佐劑充分混勻，進行皮下多點注射。每間隔兩周進行1次增強免疫，第4次增強免疫1周后頸動脈采血，分離得到抗血清。收集到的血清借助飽和硫酸銨沉淀法和DE52陰離子交換柱層析法進行純化，從而獲得兔抗ArMV多克隆抗體IgG。

1.8 ArMV CP多克隆抗體的鑒定

稱取0.1～0.2 g分別感染LSV、CMV、LMoV、PlAMV及ArMV的百合葉片組織，加入液氮研磨，按照植物蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離后， 15 V恒壓轉移至PVDF膜，轉膜后移入1%酪蛋白封閉液中，4 ℃過夜封閉。以制備的ArMV CP多克隆抗體作為一抗(1∶10 000)，AP標記的羊抗兔IgG作為二抗(1∶20 000)，通過NBT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑盒(藍色)顯色。

2 結果與分析

2.1 ArMV CP基因的克隆

以侵染東方百合雜交品種‘木門’(‘Conca D’or’)的ArMV的基因組RNA為模板，PCR擴增ArMV CP基因。電泳檢測結果顯示，得到的擴增片段大小為1.0～2.0 kb，符合預期(1 515 bp)(圖1)。將擴增的ArMV CP序列克隆于pMD-19T載體，測序結果顯示ArMV CP序列的長度為1 515 bp，編碼505個氨基酸組成的CP蛋白，推測蛋白質相對分子質量為56 ku。NCBI上提交克隆所得序列，獲得的登錄號為MT323117。

2.2 ArMV CP基因的序列分析

將克隆的百合ArMV CP基因與GenBank中不同分離物的ArMV CP基因核苷酸及氨基酸序列進行比較。BLAST結果表明，百合ArMV CP基因的核苷酸和氨基酸序列均與采自波蘭的R14_3分離物(MH316599)的相似性最高，分別為93.6%和98.2%；與其他分離物的核苷酸序列相似性為81.6%～93.5%，氨基酸序列相似性為92.2%～97.6%；與已注冊的7個百合分離物(AB279741、KJ481182、KJ481183、KJ481184、KJ481185、KJ481186和KJ481187)相比，核苷酸序列相似性為89.4%～90.2%，氨基酸序列相似性達到95.5%～96.4%。

借助DNAStar軟件分析百合ArMV CP蛋白的二級結構、親水性和柔韌性，并預測其抗原表位(圖2)；將71個不同分離物的ArMV CP蛋白氨基酸序列進行ClustalW比對，獲得ArMV CP中相似性達到90%的保守位點。在抗原性指數較高(指數≥0)的區域，選取親水性好(指數≥0)且具有β轉角或無規則卷曲結構的區域作為潛在的抗原表位(氨基酸數≥4)，對比抗原表位和保守位點的氨基酸組成，發現抗原表位所包含的61個氨基酸中保守位點占據85.2%，表明ArMV CP蛋白的抗原表位保守。

2.3 重組原核表達載體的構建

pET-28a重組質粒經PCR擴增得到約1.5 kb的條帶，長度與ArMV CP基因全長保持一致(1 515 bp)。用BamH Ⅰ和XhoⅠ切割pET-28a重組質粒，電泳檢測結果顯示，重組質粒被切割成兩條帶，分別與PCR產物(1.5 kb)和pET-28a質粒(5 kb)的大小一致(圖3)。

2.4 ArMV CP蛋白的原核表達

陽性質粒pET-28a-ArMV轉化E.coliBL21(DE3)菌株，經1.0 mmol/L IPTG誘導，SDS-PAGE分析，觀察到目的蛋白有明顯表達(圖4)。但隨著誘導時間從3 h增加到7 h，目的蛋白表達量沒有顯著變化。

2.5 Western blot免疫印跡

提取百合葉片總蛋白，經Western blot檢測，發現抗體與感染ArMV的樣品在預期大小的位置處發生特異性反應，而與健康百合樣品以及分別感染LSV、CMV、LMoV、PlAMV的樣品無交叉反應，表明抗體能夠特異性結合ArMV CP蛋白，具有很好的特異性(圖5)。

3 討 論

貿易全球化推動了中國經濟的發展，但是也為國內生物安全帶來挑戰，近些年來，海關不斷從進境的百合、水仙、郁金香等花卉植物上檢測到ArMV[15-16]。目前，該病毒的防治主要依賴于快速靈敏的血清學檢測技術，相較于核酸檢測技術，前者的優點在于避免病毒RNA提取的困難，操作簡便，并且適用于大規模的田間檢測。病毒CP蛋白在原核表達中具有較好的免疫原性，因此通常被作為抗體制備的抗原，同時借助原核表達也避開直接純化病毒所面臨的難題[17-18]。然而，國內學者選取部分ArMV CP基因進行原核表達，沒有注意到CP結構和功能的完整性。于翠等[15]使用商業化的多克隆抗體建立DAS-ELISA技術體系，從水仙種球上檢測到ArMV。一方面，商業化抗體相較于本研究所制備的抗體，對于檢測百合上ArMV的特異性可能有所降低；另一方面，ELISA檢測的結果存在非特異性的可能，無法應用于病毒蛋白表達分析，不能滿足ArMV致病機理研究的需要。本研究在此基礎上，克隆CP全長基因，表達具備完整結構與功能的CP融合蛋白。序列分析結果表明ArMV不同分離物的CP序列相似性高，抗原表位保守，因此以純化ArMV CP蛋白為抗原制備多克隆抗體，可用于檢測感染不同宿主的ArMV。此外，本研究制備的抗體效價高，建立的Western blot方法能夠用于分析病毒蛋白的表達量，可用于病毒蛋白功能的分析及致病機理的研究。

為了提高目的蛋白表達量，獲得優異的抗體，對重組蛋白誘導表達條件進行初步摸索。本研究設置蛋白誘導表達的時間梯度，探究誘導時間和蛋白表達量的關系。SDS-PAGE結果表明，增加誘導時間，ArMV CP蛋白表達量沒有發生明顯變化(圖4)。這個結論與王玉等[19]的研究并不一致，可能與兩者所用誘導劑的濃度差異有關。本研究用于誘導蛋白表達的IPTG為1.0 mmol/L，相比0.2 mmol/L濃度明顯偏高，這可能會抑制菌體的生長[20]，從而使目的蛋白的表達量在3 h達到峰值。

然而在優化誘導時間后，發現本研究獲得的ArMV CP蛋白表達量并不高，推測其原因可能與表達載體及密碼子偏性有關。谷紅等[21]構建不同的原核表達載體，發現PRRSV dORF5(去掉N端疏水序列)在pGEX-4T-2表達載體中能夠大量表達，而在pET-28a和pET-5a中不表達。即表達載體影響蛋白的高效表達，CP蛋白表達量低可能受到載體的影響。盧海強等[22]根據畢赤酵母的密碼子偏好性，優化嗜熱甘露聚糖酶ManBK的基因序列，并以此構建pPIC9K表達載體，得到高濃度的嗜熱甘露聚糖酶。密碼子偏性是普遍存在的現象，ArMV和大腸桿菌的密碼子偏性不同，這可能是制約CP蛋白表達的原因。

蛋白純化和抗體特異性檢驗也可以進行優化，從而提高抗體制備的效率。Ni-NTA柱親和層析純化時，最初獲得的純化蛋白濃度較低，后來在蛋白上樣之后增加孵育過程，即在4 ℃下孵育4～10 h，使目的蛋白與柱子的結合更加充分，顯著提高純化蛋白含量。Western blot鑒定抗體特異性的過程中封閉是非常重要的環節之一，只有背景干凈的顯色結果才具有說服力。尤其是對于化學顯色檢測系統，因檢測靈敏度極高，對背景信號的要求非常嚴格。本研究最初選擇脫脂奶粉和BSA作為封閉劑，但是顯色結果中均出現較高的背景，這可能是因為脫脂奶粉和BSA自身具有的一定的堿性磷酸酶活性造成的結果[23]。為消除內源性的堿性磷酸酶活性，選擇酪蛋白作為封閉劑，成功降低顯色背景，驗證多克隆抗體的特異性[24]。

ArMV是世界上一種重要的植物病害，本研究構建ArMV CP基因原核表達載體，制備ArMV CP蛋白的多克隆抗體，可以為ArMV的血清學檢測和致病機理的研究提供一定參考。