99mTc 標(biāo)記靶向EGFR 納米探針的優(yōu)化條件探索

劉 湘，孫云鋼

（1 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院南院門(mén)診西藥房 廣東 廣州 510000）

（2 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 廣東 廣州 510280）

表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是一種具有酪氨酸激酶活性的膜表面?zhèn)鞲衅鱗1]，普遍表達(dá)于人體的表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，并且在人體許多腫瘤細(xì)胞中存在過(guò)度表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、放化療敏感性以及預(yù)后等關(guān)系非常密切，已成為腫瘤診治的重要分子靶。基于納米材料的多模態(tài)分子影像可以實(shí)現(xiàn)各種非侵入性成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，為腫瘤的早期診斷帶來(lái)了新的希望，是近年來(lái)的前沿研究領(lǐng)域[2]。目前國(guó)內(nèi)外鮮有以EGFR 為腫瘤靶向、應(yīng)用于雙模態(tài)SPECT/MR 成像的相關(guān)報(bào)道。本研究以GE11-CS-SPION 為被標(biāo)記物，將99mTc 標(biāo)記于其表面。通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化及驗(yàn)證99mTc-GE11-CS-SPION 的最適標(biāo)記條件。本研究探索了納米載體應(yīng)用于腫瘤特異性SPECT/MRI 顯像的可能性，為腫瘤的早期預(yù)警、診斷和治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.資料與與方法

1.1 一般資料

材料HEPES, GIBCO；NaOH，國(guó)藥化學(xué)；HCl，國(guó)藥化學(xué)；Na99mTcO4，廣州原子高科科技有限公司提供，放化純＞98.0%；氯化亞錫（美國(guó)Sigma 公司）；恒溫水箱，江蘇金壇市中大儀器廠；微機(jī)放射性活度計(jì)，F(xiàn)J-391A2 型，北京核儀器廠。

1.2 方法

（1）將SnCl2（1.0 mg/mL，溶于0.1 mol/L HCl溶液）加入小青霉素瓶中，加入Na99mTcO4 溶液，放置20 min 后再加入GE11-CS-SPION 溶液（質(zhì)量濃度1 mg/mL）體積100 μL，于室溫下反應(yīng)半小時(shí)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中都通氮?dú)獗Ｗo(hù)。測(cè)定已充分反應(yīng)的混合物放射性活度。用移液器置于超濾管（30k）內(nèi)，置于離心機(jī)上離心（條件：13 400 rpm，6 min）。納米粒子GE11-CSSPION 用HEPES（0.1 M，pH 7.1）清洗三次，并在此置于離心機(jī)內(nèi)離心，離心條件同上。將上述在此離心后的超濾管取出，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，用適量的HEPES 在此充分沖洗超濾管的濾膜，最后的沖洗液即是所標(biāo)記的納米載體，測(cè)定其活度。99mTc-GE11-CS-SPION 的標(biāo)記率=（標(biāo)記物活度/總活度）×100%。因?yàn)?9mTc-GE11-CS-SPION的標(biāo)記率直接影響到該探針的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛能，也是實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物SPECT 顯像的關(guān)鍵，所以本實(shí)驗(yàn)以標(biāo)記率為指標(biāo)，單因素考察制備過(guò)程中的幾個(gè)重要參數(shù)。（2）調(diào)整反應(yīng)體系的pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5），固定水浴溫度20℃孵育10 min，按照上述方法制備標(biāo)記物，考察pH 值對(duì)99mTc-GE11-CS-SPION 標(biāo)記率的影響，確定最適反應(yīng)體系的pH 值。（3）調(diào)整反應(yīng)體系的水浴溫度（20℃、90℃），固定好最適pH 值，按照上述方法制備標(biāo)記物，考察溫度對(duì)99mTc-GE11-CS-SPION 標(biāo)記率的影響。（4）調(diào)整反應(yīng)體系的時(shí)間（10 min、30 min、60 min），固定好最佳pH 值、載體濃度按照上述方法制備標(biāo)記物，考察孵育時(shí)間對(duì)99mTc-GE11-CS-SPION 標(biāo)記率的影響。在確定最適pH 后，配置0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL 的GE11-CS-SPION 溶液。按照上述方法制備標(biāo)記物，考察納米載體不同濃度對(duì)99mTc-GE11-CS-SPION 標(biāo)記率的影響。以單因素考察優(yōu)化出來(lái)的工藝參數(shù)為較優(yōu)條件的方法制備3 批，測(cè)定其標(biāo)記率，考察優(yōu)化制備條件的可重復(fù)性。

2.結(jié)果

通過(guò)不同pH 制備得到的99mTc-GE11-CS-SPION 標(biāo)記率結(jié)果。確定較優(yōu)制備條件是：Na99mTcO4 74 MBq；靶向納米顆粒GE11-CS-SPION（質(zhì)量濃度1 mg/mL）體積100 μL；水浴溫度20℃；孵育時(shí)間10 min。按照這個(gè)較優(yōu)制備條件制備3 批99mTc-GE11-CS-SPION，測(cè)定標(biāo)記率分別為92.53%、94.64%、91.87%，見(jiàn)表1 ～4。

表1 不同pH 值的標(biāo)記率

表2 不同溫度的標(biāo)記率

表3 不同反應(yīng)時(shí)間的標(biāo)記率

表4 不同納米載體質(zhì)量的標(biāo)記率

3.討論

目前臨床應(yīng)用于腫瘤的分子影像技術(shù)有光學(xué)成像、CT、MRI、超聲和單光子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（SPECT）、正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET）等。整合各種分子影像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)于一體的多模態(tài)分子影像進(jìn)行腫瘤分子成像是近年來(lái)的研究重點(diǎn)，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)和先決條件是設(shè)計(jì)和制備能特異性結(jié)合于體內(nèi)分子靶并可被探測(cè)到的多模態(tài)分子探針，而納米技術(shù)為雙（多）模態(tài)分子探針的構(gòu)建提供了重要平臺(tái)支撐。

放射性核素99mTc 因?yàn)槠漭^純的低能γ 射線（140 keV）、較短的半衰期（6.03 h）和輻射損傷小且價(jià)廉易得等優(yōu)點(diǎn)而成為目前核素顯像應(yīng)用最廣泛的顯像劑，其標(biāo)記于SPION 的方法主要有直接標(biāo)記法和DTPA 或bispHospHonates 為螯合劑的間接標(biāo)記法，文獻(xiàn)報(bào)道直接標(biāo)記法的標(biāo)記率可達(dá)99%[3]。SPECT 是核醫(yī)學(xué)最常見(jiàn)和應(yīng)用最廣泛的醫(yī)學(xué)影像設(shè)備，它既繼承了γ 照相機(jī)的功能和特性，又融合了計(jì)算機(jī)斷層的原理，因此其突出優(yōu)點(diǎn)是，可高靈敏地反映人體功能和代謝方面的變化。

由于超順磁性納米粒子的制作簡(jiǎn)單，其直徑一般小于30 nm，具有比表面積效應(yīng)和磁效應(yīng)，在外加磁場(chǎng)的作用下可具有靶向性，且四氧化三鐵的晶體對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。在磁性四氧化三鐵的晶體表面可很容易地包埋生物高分子，如多聚糖、蛋白質(zhì)等形成核殼式結(jié)構(gòu)，可使其達(dá)到生物相容性，使其成為MRI 重要的T2 對(duì)比劑，越來(lái)越多地應(yīng)用于腫瘤分子影像領(lǐng)域研究[4]。

為了達(dá)到SPECT 分子影像靶向示蹤的目的，我們?cè)诤铣刹襟E中引入了放射性核素99mTc。我們探討了不同的反應(yīng)條件（pH 值、溫度、納米載體濃度和反應(yīng)時(shí)間）對(duì)99mTc-GE11-CS-SPION 標(biāo)記率的影響。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，pH 值3.5 時(shí)產(chǎn)物的標(biāo)記率達(dá)到最高，正如之前研究所述，99mTc 螯合作用在pH 值為3.5 時(shí)效果最好[5]。

溫度也是影響99mTc 與納米粒子結(jié)合的重要因素之一。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在常溫下較短時(shí)間內(nèi)（10 min）99mTc 即可高效標(biāo)記于納米粒子表面，雖然反應(yīng)體系溫度的進(jìn)一步升高可略微提高標(biāo)記率，但考慮到較高溫度有可能影響多肽及納米成分結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，我們選擇常溫合成本納米探針用于后續(xù)研究。用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)效果會(huì)更好。

綜上所述，我們確定了最適納米載體質(zhì)量，在其他反應(yīng)條件固定的情況下，隨著納米載體GE11-CS-SPION的質(zhì)量濃度的增加，產(chǎn)物的標(biāo)記率也隨之提高。但是，當(dāng)納米載體的質(zhì)量超過(guò)100μg 時(shí)，產(chǎn)物標(biāo)記率無(wú)明顯上升?？赡艿脑蚴?，納米載體與锝的螯合作用已達(dá)到飽和狀態(tài)。