褪黑素對NaCl脅迫下油松葉綠素及抗氧化酶活性的影響

孫鳳萍

（山西省林業和草原資源調查監測中心，山西 太原030012）

當前全球鹽漬化耕地面積達到了全部耕地面積的20%[1]，我國鹽漬化耕地面積也達到了9913萬hm2[2]。NaCl脅迫會使植物膜系統受到破壞，影響植物的正常生長，嚴重時會導致植物死亡[3]。油松是我國很多山區造林和城鎮綠化應用較多的樹種之一，幼苗與成年樹相比耐NaCl脅迫能力差，土壤的鹽漬化嚴重影響了油松育苗工作和營林造林工作順利進行[4]。褪黑素（melatonin，MT）1958年首次分離得到，可以緩解非生物脅迫下逆境對植物的傷害，提高植物抗逆能力[5]。褪黑素具有清除鹽脅迫下植物體內多余活性氧的能力，同時提高抗氧化酶活性和滲透調節物質含量[1]，適宜濃度的褪黑素可以顯著降低鹽脅迫下芹菜的MDA含量，降低活性氧的危害[6]，提高植株對鹽脅迫的耐受能力。杜卓[7]研究認為，褪黑素可以顯著提高干旱脅迫下植物體內葉綠素含量，有利于提高植物光合能力和逆境適應能力，促進生長；杜天浩[8]研究認為，褪黑素顯著提高了NaCl脅迫下番茄葉綠素含量和抗氧化酶活性，有利于植株清除多余的活性氧以降低NaCl脅迫對番茄的傷害；王麗英[9]研究認為，褪黑素提高了黃瓜植株內抗氧化物質含量，有效緩解了NaCl脅迫造成的膜脂質過氧化作用，顯著提高了黃瓜的耐鹽性；向警[1]研究認為，適宜濃度的褪黑素顯著提高了NaCl脅迫下水稻幼苗的SOD、POD、CAT活性，增強了水稻抗氧化能力，緩解了NaCl脅迫造成的氧化損傷；張海文[10]研究認為，外源褪黑素可以提高油松抗氧化酶活性，但是外源褪黑素對NaCl脅迫下油松葉綠素含量和抗氧化酶活性變化的相關研究并未涉及。本文研究了不同濃度的褪黑素對NaCl脅迫下油松的葉綠素和抗氧化酶活性變化，以期為利用褪黑素緩解油松苗木NaCl脅迫提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年4月至7月在山西省林業和草原資源調查監測中心實驗苗圃內進行。試驗所選油松為2a生實生苗，該苗木于2018年3月2日浸種3d，3月6日播種入穴盤中，出苗后養護至6月20日，將苗木移栽入長×寬×高為35cm×30cm×35cm的塑料栽植盆內。每盆裝土20kg，每盆栽1株。苗木生長期間正常養護，防止出現旱澇災害及病蟲危害。

1.2 試驗設計

本試驗共設5個處理，T1為空白對照，無NaCl脅迫和褪黑素，T2為NaCl脅迫對照，NaCl濃度為200mmol/L；T3為NaCl+低濃度褪黑素，NaCl濃度200mmol/L+50μmol/L褪黑素；T4為NaCl+中等濃度褪黑素，NaCl濃度200mmol/L+100μmol/L褪黑素；T5為NaCl+高濃度褪黑素，NaCl濃度200mmol/L+150μmol/L褪黑素。其中，T2、T3、T4、T5處理NaCl灌入量為2000mL/盆，分兩次處理，即4月15日澆入1000mL，5月15日澆入1000mL。褪黑素共處理2次，第一次為4月22日至25日連續3d噴施，每天噴施量為50mL/株；第二次為5月22日至25日，每天噴施量為50mL/株，噴施時間為下午18：00以后。T1處理在4月15日和5月15日分別澆入1000mL的蒸餾水，T1、T2處理在4月22日至25日、5月23日至26日每天噴施50mL/株的清水。每處理共設置20盆，3次重復。整個試驗期間防止病蟲危害和旱澇災害。

1.3 測定項目

分別于5月5日、5月20日、6月5日、6月20日取樣，每處理選取6株油松苗木，每2株作為一個重復，剪取葉片2g，取0.5g用于測定葉綠素含量，其余葉片放入液氮中冷凍30min后轉入-40℃冰箱中保存，用于測定抗氧化酶活性。其中，葉綠素含量測定采用浸提法[11]，SOD活性測定采用NBT還原法[12]，POD活性測定采用愈創木酚法[12]，CAT活性測定采用紫外吸收法[12]。各項指標分別測定5次，取平均值作為最后結果。

1.4 數據處理

圖表制作及數據處理均使用Excel2010版軟件，方差分析使用DPS7.05版軟件。

2 結果與分析

2.1 褪黑素對NaCl脅迫下油松葉綠素a含量的影響

由圖1可知：NaCl脅迫在整個試驗期間均顯著降低了油松葉片內的葉綠素a含量，褪黑素處理與NaCl處理相比顯著提高了葉綠素a含量，不同濃度的褪黑素對葉綠素a含量的影響不同。整個試驗期間，T4葉綠素a含量處于最高值，與T2處理相比分別提高了0.43mg/g、0.48mg/g、0.57mg/g、0.92mg/g，差異顯著，表明100μmol/L褪黑素與NaCl處理相比顯著提高了油松葉片內的葉綠素a含量。5月5日至6月5日，3個濃度的褪黑素處理葉綠素a含量處于同一水平，表明不同濃度的褪黑素在該時間段內不會對油松葉綠素a含量產生顯著影響。6月20日，T4分別高于T1、T2、T3處理0.6 5mg/g、0.92mg/g、0.57mg/g，差異顯著，表明100μmol/L與50μmol/L褪黑素處理相比在6月20日對提高葉綠素a含量效果達到了顯著水平；T5低于T4處理0.16mg/g，無顯著差異，表明褪黑素含量從T4提高至T5對葉綠素a含量的影響不顯著。

圖1 褪黑素對NaCl脅迫下油松葉綠素a含量的影響

2.2 褪黑素對NaCl脅迫下油松葉綠素b含量的影響

由圖2可知：整個試驗期間，NaCl處理與空白對照相比顯著降低了油松葉片內葉綠素b含量，褪黑素處理與NaCl處理相比顯著提高了葉綠素b含量，不同濃度褪黑素處理對葉綠素b含量的影響存在差異。整個試驗期間，T4分別高于T2處理0.50mg/g、0.65mg/g、0.60mg/g、0.72mg/g，差異顯著，表明100μmol/L褪黑素與NaCl處理相比具有顯著提高油松葉片內葉綠素b含量的作用。整個試驗期間T4均顯著高于T1，表明該濃度的褪黑素與空白對照相比有顯著提高油松葉片內葉綠素b含量的作用；T3、T5與T1之間無顯著差異，表明這兩個濃度的褪黑素與空白對照相比不會對油松葉綠素b含量產生顯著影響。5月5日與6月5日，T3、T4、T5處理的葉綠素b含量處于同一水平，表明不同濃度的褪黑素在這兩個時間點不會對葉綠素b含量產生顯著影響；5月20日和6月20日，T4葉綠素b含量分別高于T3處理0.33mg/g、0.39mg/g，差異顯著，表明在這兩個時間點褪黑素濃度由100μmol/L降低至50μmol/L會顯著降低油松葉片內葉綠素b含量。T5與T4之間無顯著差異，表明褪黑素濃度由T4提高至T5不會對油松葉綠素b含量產生顯著影響。

圖2 褪黑素對NaCl脅迫下油松葉綠素b含量的影響

2.3 褪黑素對NaCl脅迫下油松SOD活性的影響

由圖3可知：NaCl處理與空白對照相比顯著提高了油松SOD活性，褪黑素處理與NaCl處理相比同樣提高了油松葉片內SOD活性。從試驗結果來看，5月5日至6月20日，T4與T2相比SOD活性分別提高了26.92%、24.42%、33.10%、32.44%，差異顯著，表明100μmol/L的褪黑素與NaCl處理相比顯著提高了油松葉片內SOD活性；T3與T2處理之間無顯著差異，表明50μmol/L的褪黑素不能顯著提高NaCl脅迫下油松的SOD活性；5月20日至6月20日，T4顯著高于T3處理，表明褪黑素濃度從50μmol/L提高至100μmol/L會顯著提高NaCl脅迫下油松葉片內的SOD活性；T5在整個試驗期間均顯著高于T2處理，表明150μmol/L的褪黑素同樣可以顯著提高NaCl脅迫下油松葉片內SOD活性；T5與T4之間無顯著差異，表明褪黑素濃度從100μmol/L提高至150μmol/L不會對油松SOD活性產生顯著影響。

圖3 褪黑素對NaCl脅迫下油松SOD活性的影響

2.4 褪黑素對NaCl脅迫下油松POD活性的影響

由圖4可知：NaCl處理與空白對照相比提高了油松葉片的POD活性，其中5月5日T2與T1之間無顯著差異，5月20日至6月20日兩個處理之間存在顯著差異，表明NaCl脅迫會顯著提高油松葉片內的POD活性。噴施褪黑素與NaCl處理相比，在整個試驗期間均提高了油松葉片內POD活性，不同濃度的褪黑素對油松POD活性的影響存在差異。整個試驗期間，T4與T2相比POD活性分別提高了48.29%、40.06%、36.48%、52.30%，差異顯著，表明100μmol/L的褪黑素與NaCl處理相比會顯著提高油松葉片內的POD活性。T3與T2相比分別提高了7.89%、12.80%、13.02%、20.17%，無顯著差異，表明50μmol/L的褪黑素與NaCl脅迫處理相比不能顯著提高油松葉片內的POD活性。5月5日和6月5日，T5分別高于T4處理0.43U/g、0.38U/g，無顯著差異，5月20日和6月20日T5與T4之間無顯著差異，表明褪黑素濃度從100μmol/L升高至150μmol/L不會對油松POD活性產生顯著影響。

圖4 褪黑素對NaCl脅迫下油松POD活性的影響

2.5 褪黑素對NaCl脅迫下油松CAT活性的影響

由圖5可知：NaCl脅迫下，油松葉片內的CAT活性顯著升高，褪黑素處理與NaCl處理相比顯著提高了CAT活性，但是不同濃度的褪黑素對油松CAT活性影響存在差異。5月5日，T4比T2處理提高了18.42%，差異顯著，T3、T5與T4之間無顯著差異，表明不同濃度的褪黑素在處理后10d對油松CAT活性的影響處于同一水平，T3、T5與T2之間無顯著差異，表明T3、T5在5月5日與T2相比不會對油松CAT活性產生顯著影響。5月20日至6月20日，T4與T2相比分別提高了20.51%、28.08%、24.22%，差異顯著，表明100μmol/L的褪黑素與NaCl處理相比會使油松葉片內CAT活性顯著升高；T3分別低于T4處理4.71U/g、6.19U/g、7.05 U/g，差異顯著，表明褪黑素濃度從100μmol/L降低至50μmol/L會使油松CAT活性顯著降低；T5與T4之間無顯著差異，表明褪黑素濃度提高至150μmol/L不會對油松葉片內CAT活性產生顯著影響。

圖5 褪黑素對NaCl脅迫下油松CAT活性的影響

3 討論與結論

NaCl脅迫會直接影響植物的葉綠素代謝過程，長時間的NaCl脅迫會降低葉綠素的合成量和提高葉綠素降解速率，從而導致葉片內葉綠素含量降低[13]。本試驗中，油松葉片內葉綠素a、b含量在NaCl脅迫下會顯著降低，而褪黑素處理的葉綠素a和葉綠素b含量均顯著升高，這與羅黃穎[14]的研究結果相似，分析原因認為可能與褪黑素可以緩解NaCl脅迫下葉綠素合成障礙，同時降低葉綠素降解速率有關。

植物在NaCl脅迫條件下體內產生大量的活性氧，從而使細胞膜遭受破壞和代謝紊亂，導致植物體早衰，甚至死亡[15]。植物在長期的進化過程中形成了一套清除過多活性氧的抗氧化酶系統，SOD、POD、CAT是植物體內最重要的3種抗氧化酶，對清除植物體內多余的活性氧和防止膜系統受到破壞起著重要作用[16]。本試驗結果中，褪黑素處理與NaCl處理相比顯著提高了油松葉片內的SOD活性，這與喬沛[17]的研究結果相似，表明褪黑素對提高植物體內SOD活性，降低NaCl脅迫危害具有重要作用。

從POD活性變化上來看，50μmol/L的褪黑素與100μmol/L處理相比顯著降低了油松葉片內的POD活性，并且50μmol/L的褪黑素處理與NaCl脅迫處理的POD活性無顯著差異，說明50μmol/L的褪黑素并未顯著提高油松POD活性，這與陳莉[18]的研究結果不同，分析原因認為這可能與褪黑素對植物不同器官的作用存在差異有關。褪黑素濃度從100μmol/L提高至150μmol/L時，POD濃度在5月20日和6月20日表現出降低的變化，這與彭玲[19]的研究結果一致，說明高濃度的褪黑素會降低植物體內POD活性。CAT活性變化與POD相似，100μmol/L的褪黑素顯著提高了NaCl脅迫下油松葉片內的CAT活性，這與何松榆[20]的研究結果一致，表明褪黑素可以顯著提高NaCl脅迫下的油松葉片內抗氧化酶活性，防止活性氧的積累導致油松膜系統受到傷害，從而維持正常生理生化過程的進行。綜上分析來看，100μmol/L的褪黑素可以顯著提高NaCl脅迫下油松葉片內葉綠素含量和抗氧化酶活性。