基于微滴數(shù)字PCR技術(shù)鑒別豬肉摻假方法的建立及評(píng)估

王溪橋，解迎雙，周小平，丁功濤，馬忠仁，Nurul Izza Nordin

（1.蘭州海關(guān)技術(shù)中心，甘肅 蘭州730010；2.西北民族大學(xué)，甘肅 蘭州730124；3.Industrial Biotechnology Research Centre，SIRIM Berhad）

0 引言

由于食品食譜和飲食習(xí)慣的快速變化，食品安全在當(dāng)今世界引起了極大的關(guān)注，而肉及肉制品的摻假一直是世界性問題，在商業(yè)加工肉類中識(shí)別豬肉是食品工業(yè)中最關(guān)鍵的問題之一。因此，需要開發(fā)一種準(zhǔn)確的豬肉檢測(cè)方法，防止食品摻假[1]，用于識(shí)別肉制品中豬肉，現(xiàn)有檢測(cè)方法依賴于蛋白質(zhì)或DNA分析。基于蛋白質(zhì)的分析方法包括免疫學(xué)分析、色譜法和肽檢查[2]。但是，基于蛋白質(zhì)的分析方法可能不適用于加工的肉制品，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)可能在加工過程中變性。而基于DNA的分析，如聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），Real time PCR，PCR限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）等在識(shí)別假冒肉類產(chǎn)品中的使用更為頻繁，因?yàn)檫@些方法可以檢測(cè)少量的DNA并擴(kuò)增特定的靶區(qū)域，而且基于DNA的分析還具有許多優(yōu)勢(shì)，包括簡單、快速、敏感和特異性[3]。試驗(yàn)采用微滴數(shù)字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）技術(shù)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增豬基因組DNA特定區(qū)域的引物和探針，建立豬源性肉的檢測(cè)方法并評(píng)估了這種方法的特異性和靈敏性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有肉品材料均購自于北京美廉美超市，所有肉類均選用新鮮組織的肌肉組織，研究前將所有肉品的肥肉和結(jié)締組織去除；QuantiTMPicoGreen R dsDNA Kit試劑盒，英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司提供；ddPCR Master、MixDroplet Generation、Oil-Dr oplet Reader Oil，美國伯樂公司提供；快速DNA提取檢測(cè)試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司提供；引物和探針，上海英濰捷基公司合成。

1.2 主要儀器

Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白檢測(cè)儀（Thermo Scientific，美國）；QX100 Droplet Digital PCR系統(tǒng)包括微滴生成儀和微滴讀取儀（Bio-Rad,美國）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 DNA提取

肉類肌肉組織基因組DNA的提取參照快速DNA提取檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，提取的DNA通過超微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)濃度和純度。

2.2 ddPCR反應(yīng)

以豬源性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因（NC_010454.3）為檢測(cè)目標(biāo)，以FAM標(biāo)記的探針進(jìn)行定量檢測(cè)，探針序列為：5'-FAM-TCACAGGCGTGGGCTTTCTGC-BHQ1-3'，上游引物序列為：5'-ACCCAGACGAACTGCTCA A-3'，下游引物序列為：5'-TGGCGTCACTGATAGGT AAAT-3'。ddPCR反應(yīng)包括配制體系、生成微滴、擴(kuò)增循環(huán)和信號(hào)讀取4個(gè)步驟。ddPCR體系：10 μL 2×ddPCR Master Mix，10 μmol/L豬源性特異性正向引物和反向引物各1 μL、探針0.5 μL，DNA模板2 μL（模板質(zhì)量濃度精確至40 ng/μL），ddH2O補(bǔ)至20 μL。生成微滴：將20 μL PCR體系和70 μL微滴生成油（droplet generation oi）l加入微滴生成卡，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴，鋪板至96孔PCR板。擴(kuò)增循環(huán)：94℃，10 min預(yù)變性；94℃15 s，60℃60 s，45個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行98℃、10 min的熱失活，每個(gè)模板重復(fù)5個(gè)平行檢測(cè)孔。信號(hào)讀?。簩U(kuò)增的96孔板置入微滴讀取儀中讀取信號(hào)，使用軟件QuantaSoft V1.3.2.0分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得絕對(duì)定量數(shù)值。

2.3 豬源性ddPCR檢測(cè)體系特異性檢測(cè)

以豬的肌肉組織為研究靶標(biāo)，選取不同物種的羊肌肉組織、牛肌肉組織、馬肌肉組織、驢肌肉組織、鴨肌肉組織、鵝肌肉組織和兔肌肉組織為特異性鑒定的研究對(duì)象，驗(yàn)證試驗(yàn)中豬源性ddPCR檢測(cè)方法的特異性，所有組織進(jìn)行ddPCR反應(yīng)方法與2.2中反應(yīng)體系相同。

2.4 豬源性ddPCR檢測(cè)體系定量范圍及檢測(cè)限驗(yàn)證

定量范圍是指試驗(yàn)中ddPCR檢測(cè)方法所能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定定量檢測(cè)的豬源性基因拷貝數(shù)范圍。根據(jù)現(xiàn)階段較為通用的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)要求，定量檢測(cè)范圍內(nèi)的點(diǎn)應(yīng)滿足線性擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)＞0.95，并且所有組內(nèi)檢測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）＜25%。由全式金公司合成豬源性內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增序列，并構(gòu)建至pEASY-T5-Pork標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)過超微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定濃度（ng/μL），以（6.02×102）3×（ng/μL×10-）9/（DNA堿基長度×660）=拷貝數(shù)（copies）/μL計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度下的靶標(biāo)基金拷貝數(shù)，通過將原始質(zhì)粒分子進(jìn)行梯度稀釋，得到理論拷貝數(shù)分別為2 000，1 000，200，100，20，10，2，0 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒溶液，以此為DNA模板，參照2.2中ddPCR反應(yīng)方法進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)行豬源性ddPCR檢測(cè)體系定量范圍及檢測(cè)限的驗(yàn)證。

2.5 豬源性ddPCR檢測(cè)體系在摻雜量樣本中的驗(yàn)證

建立豬肉和羊肉的混合樣本，其中豬肉成分占比分別為100%，10%，5%，1%，0。參照2.1提取DNA，以此為模板，通過2.2數(shù)字PCR反應(yīng)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，以ddPCR的定量計(jì)算方式得到混合樣品中豬源性贗本的實(shí)際樣品拷貝數(shù)，以《轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)豬內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性PCR方法》（農(nóng)業(yè)部2122號(hào)公告-1-2014）標(biāo)準(zhǔn)方法為對(duì)照，驗(yàn)證豬源性ddPCR檢測(cè)體系的靈敏度和穩(wěn)定性。

2.6 結(jié)果的計(jì)算與統(tǒng)計(jì)

ddPCR是一種絕對(duì)定量技術(shù)，不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可直接測(cè)得待測(cè)樣中靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)。

ddPCR的計(jì)算公式為：

式中：A——反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)；

X——數(shù)字PCR的陽性體系數(shù)；

N——總體系數(shù)。

計(jì)量資料描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 豬源性ddPCR檢測(cè)體系特異性驗(yàn)證結(jié)果

微滴讀取儀熱點(diǎn)圖顯示，豬源性ddPCR檢測(cè)體系在其他的物種中無擴(kuò)增現(xiàn)象，特異性可以滿足實(shí)際檢測(cè)工作。

豬源性數(shù)字PCR檢測(cè)體系特異性驗(yàn)證見圖1。

圖1 豬源性數(shù)字PCR檢測(cè)體系特異性驗(yàn)證

3.2 定量范圍及檢測(cè)限驗(yàn)證結(jié)果

ddPCR反應(yīng)熱點(diǎn)可以看出，ddPCR反應(yīng)陽性點(diǎn)與陰性點(diǎn)的區(qū)分非常明顯，結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，試驗(yàn)結(jié)果不會(huì)受到熒光閾值限變化的影響。

不同豬源性基因拷貝數(shù)含量下數(shù)字PCR反應(yīng)熱點(diǎn)圖見圖2。

圖2 不同豬源性基因拷貝數(shù)含量下數(shù)字PCR反應(yīng)熱點(diǎn)圖

ddPCR檢測(cè)體系在10～2 000 copies/μL的范圍內(nèi)具有較高的檢測(cè)線性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒已知拷貝數(shù)求得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.058X-11.48，R2值為0.991 3大于0.95，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)拷貝數(shù)求得不同組內(nèi)的RSD值小于25%；由于數(shù)字PCR的方法在較高濃度下同樣具有較高的精確性和穩(wěn)定性。因此，未進(jìn)行檢測(cè)上限的驗(yàn)證；在模板為2 copies/μL的檢測(cè)管中可以出現(xiàn)陽性結(jié)果，但是所有平行重復(fù)不全為陽性，所有檢測(cè)下限定體系為10 copies/μL。

豬源性基因拷貝數(shù)數(shù)字PCR定量結(jié)果分析見表1。

表1 豬源性基因拷貝數(shù)數(shù)字PCR定量結(jié)果分析

3.3 豬源性ddPCR檢測(cè)體系在摻雜量樣品驗(yàn)證結(jié)果

以混合樣品進(jìn)行稀釋豬源性樣品，結(jié)果顯示檢測(cè)方法可以特異性地識(shí)別不同成分含量混合樣品中的豬源性成分，并且相比標(biāo)準(zhǔn)方法，具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性。

雙重?cái)?shù)字PCR實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 雙重?cái)?shù)字PCR實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

對(duì)于摻假肉檢驗(yàn)而言，由PCR技術(shù)興起的DNA檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的最為迅速[4]。相對(duì)于蛋白標(biāo)志物而言，DNA分子具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性，而且依據(jù)基因保守序列的特異性，鑒定不同物種在基因組DNA層面較易實(shí)現(xiàn)。PCR技術(shù)具有級(jí)聯(lián)放大、特異性強(qiáng)、敏感性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，只要給予模板，根據(jù)特異性的引物就可以識(shí)別特異性的物種，在PCR技術(shù)平臺(tái)上發(fā)展了很多種檢測(cè)技術(shù)。多重PCR即在反應(yīng)體系中加入多個(gè)物種檢測(cè)特異性引物，蘇葳藝等人[5]利用多重PCR方法可同時(shí)檢測(cè)牛肉中摻雜雞肉、豬肉、鼠肉任意3種肉類混合樣品，且檢出限均達(dá)到1%的摻雜量。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可在反應(yīng)過程中加入相應(yīng)的染料，建立可視化的簡易擴(kuò)增技術(shù)。Ya Shi等人[6]采用LAMP方法，結(jié)合羥萘酚藍(lán)染料，建立了鴨肉的檢測(cè)方法，顯示與其他4種肉類無交叉反應(yīng)，敏感性可檢測(cè)3 pg鴨肉DNA?；诿庖邆?cè)向?qū)游觯↙ateral-flow strip(LFS）)技術(shù)平臺(tái)，將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，偶聯(lián)至快速檢測(cè)條載體上，從而實(shí)現(xiàn)快遞檢測(cè)及可視化的目的。Panzhu Qin等人[7]利用FITC和生物素修飾的引物組對(duì)摻假鴨肉的目標(biāo)DNA進(jìn)行現(xiàn)場擴(kuò)增，從而產(chǎn)生大量雙鏈DNA（dsDNA）用FITC和生物素雙重標(biāo)記的產(chǎn)品。產(chǎn)品的FITC標(biāo)記的末端與檢測(cè)條測(cè)試線上預(yù)先固定的FITC抗體結(jié)合，生物素標(biāo)記的末端與鏈霉親和素結(jié)合的金納米粒子結(jié)合，從而在LFS上形成可見的檢測(cè)線用于快速鑒別摻假牛肉中的鴨肉，可以檢出低至0.05%的摻假率。而普通PCR只能用于定性檢測(cè)，Real time PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。Li Ting Ting等人[8]設(shè)計(jì)了新型的基于參考引物的實(shí)時(shí)PCR方法，用于定量測(cè)定摻入豬肉的山羊肉，通過計(jì)算Ct的比率（特異性/參考值），可以推斷出摻入豬肉的含量。為了提高Real time PCR技術(shù)的靈敏性，基于TaqMan探針的Real time PCR技術(shù)應(yīng)用在檢測(cè)領(lǐng)域。Fang X等人[9]對(duì)嚙齒動(dòng)物鼠類靶標(biāo)基因線粒體細(xì)胞色素b基因（cytb）設(shè)計(jì)TaqMan探針進(jìn)行檢測(cè)，顯示最低檢測(cè)下限為0.25 pg DNA時(shí)即可完成檢測(cè)，而肉類摻雜量低至0.1%。

經(jīng)典PCR可用于定性或定量研究靶分子的性質(zhì)或確定靶分子的數(shù)量，ddPCR的不同之處在于在微滴中將樣品分配到單個(gè)分子的水平，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得全或無信號(hào)，即數(shù)字信號(hào)，并使用泊松分布（Poisson Distribution）分析靶分子的性質(zhì)或計(jì)算靶分子的數(shù)目[10]。因?yàn)閐dPCR技術(shù)具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，其獨(dú)立于標(biāo)準(zhǔn)曲線迅速發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于下一代測(cè)序和檢測(cè)領(lǐng)域，如基因突變、拷貝數(shù)變異、微生物和轉(zhuǎn)基因食品。有研究證實(shí)ddPCR方法，用于定量測(cè)定綿羊和山羊肉產(chǎn)品中雞肉的含量，與Real time PCR相比，ddPCR的性能更精確、靈敏和穩(wěn)定[11]。試驗(yàn)針對(duì)ddPCR技術(shù)平臺(tái)，設(shè)計(jì)了豬源性肉類的檢測(cè)方法，結(jié)果顯示特異性較強(qiáng)，在羊、牛、馬、驢、鴨、鵝和兔物種無交叉，針對(duì)檢測(cè)限進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA系列梯度的擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR檢測(cè)體系在10～2 000 copies/μL的范圍內(nèi)具有較高的檢測(cè)線性，R2值為0.991 3大于0.95，RSD值小于25%，盡管為2 copies/μL的檢測(cè)管中可以出現(xiàn)陽性結(jié)果，但是所有平行重復(fù)不全為陽性，摻雜量檢出中與標(biāo)準(zhǔn)Real time PCR方法進(jìn)行了對(duì)比，顯示在摻雜量為1%的樣本中擁有很好的靈敏度和穩(wěn)定性。因此，試驗(yàn)中建立的基于ddPCR的檢測(cè)方法在實(shí)際應(yīng)用中具有十分重要的價(jià)值。

隨著市場的快速多元化發(fā)展，應(yīng)該充分利用技術(shù)進(jìn)步和儀器領(lǐng)域的提升開辟新的路徑，建立高效準(zhǔn)確摻假肉檢測(cè)方法，讓摻假肉鑒別技術(shù)在快速檢測(cè)的同時(shí)，盡可能地保證高特異性和高靈敏度，實(shí)現(xiàn)各種摻雜量情況下均可準(zhǔn)確得出摻雜量比例，為廣大消費(fèi)者及執(zhí)法部門提供安全、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，為肉類食品安全和肉類食品消費(fèi)提供保障。