常壓室溫等離子誘變選育微生物的研究進展

徐禮生，于巧玲，張興桃，蔣變玲，李婷婷

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州234000）

0 引言

常壓室溫等離子體誘變（ARTP）是在常壓室溫下產生高濃度均勻等離子體射流，這種射流與細胞作用明顯，產生高密度高活性均勻粒子，誘變所需溫度低。與傳統的物理誘變技術相較具有明顯優勢，所以在工業生產中常被使用[1-2]。ARTP通過高活性粒子可改變微生物核苷酸結構進而誘變得到目的細胞產物，使突變株具有良好穩定性，無需真空裝置，操作簡單[3]。雖然，化學誘變在單獨和復合作用較為明顯，但在化學誘變應用過程中易引起的環境污染問題。ARTP系統DNA損傷大，突變率高于化學誘變和紫外線誘變。在ARTP系統中以氦氣作為主要氣體，不會產生有害物質[4-5]。

1 ARTP在細菌誘變方面的應用

ATRP技術誘變產生枯草芽孢桿菌，通過以不產生脂肽作為篩選標記得到高產菌株[6]。常壓室溫等離子誘變脫氮假單胞菌，將目的基因進行擴增導入脫氮假單胞菌，通過ARTP誘變處理產生高效高產的維B12產生菌，通過高通量篩選出高產菌株[7]。袁紅梅等人[8]通過ARTP誘變枯草芽孢桿菌使其產生大量腺苷，腺苷產生菌對于ARTP特別敏感，經過初篩和復篩得到高產腺苷高產菌。利用ARTP選育微生物谷氨酰胺轉胺酶高產菌株茂源鏈霉菌，通過其誘變致死率和突變率計算，高通量篩選和復篩選育出目的菌種進行培育[9-10]。利用氦作為工作氣體的大氣等離子體（ARTP）處理新金分枝桿菌方法，突變體中新奧金菌被認為是工業應用最佳菌株[11]。ATRP技術對植物乳桿菌進行誘變，通過單因素試驗，以及溶鈣圈法和酸度測定等測試方法選育出產酸量高且發酵穩定乳酸菌菌株，不僅操作簡便，同時節約成本[12]。ARTP通過高密度的粒子流，可與生物大分子作用改變細胞結構，使細胞遺傳物質結構發生突變（堿基的缺失替換等）并且結合不同的篩選方法選育所需菌株。研究枯草芽孢桿菌BS120，對其進行ARTP等離子誘變處理，以8-氮寡霉素和鳥嘌呤作為篩選拮抗物篩選遺傳穩定且核黃素產量高的菌株[13-14]。ARTP等離子誘變紅霉素產生菌紅色多糖多孢菌，結合紫外進行復合誘變，使菌株平均發酵效價較出發菌提高了25.2%[15]。常壓室溫等離子體-紫外復合誘變育β-法尼烯高產菌株大腸桿菌，通過復合誘變進一步提高了正突變株的突變率，正突變率提高43.3%[16]。常壓室溫等離子誘變技術可有效地通過高密度的活性粒子與生物大分子作用，或者通過改變細胞膜的通透性進而改變遺傳物質的結構，達到誘變育種目的[17]。

2 ARTP在真菌誘變方面的應用

常壓室溫等離子誘變技術在真菌方面也具有重大應用價值，該技術在黑曲霉菌、米曲霉菌、紅曲菌等真菌誘變育種應用廣泛[1]。研究單寧酶高產菌株黑曲霉，ARTP可快速誘變黑曲霉，通過固態搖瓶發酵和液態搖瓶發酵，得出菌株酶活性是出發菌株的1.64倍。由此得出，在最佳時間、溫度、單寧酸濃度、葡萄糖濃度在經過ARTP誘變處理的黑曲霉菌株產單寧酶效率顯著提高[18]。曲酸是微生物有氧發酵具有抑制酪氨酸酶作用的有機酸，可作為食品防腐劑、美白劑或保鮮保色劑等。通過ARTP技術對米曲霉進行誘變處理，再通過96孔板高通量篩選得到了曲酸產量穩定的米曲霉菌株，較出發菌株曲酸產量增加31.48%[19]。紅曲菌是產橙和黃色素的一種真菌，可以作為食品生產中的著色劑。通過物理誘變紫外超聲波和化學誘變硫酸二乙酯，氯化鋰誘變紅曲菌。但是，這2種方法突變率低，成本高且后者對環境有污染，通過利用ARTP技術，選擇高產菌M1代培養，經18代傳代培養，色素吸收光譜圖顯示橙，黃色素較出發菌有明顯增加[20]。研究高產木糖醇產生菌酵母念珠菌，通過ARTP技術突變得到200多個突變菌株，選育出產量最高T13[21]。對桑黃原生質體進行ARTP等離子誘變，黃酮產生量提高86.7%，進而證明ARTP干預了桑黃菌體內產生黃酮化合物的代謝過程[2]。

3 ARTP在酵母誘變方面的應用

常壓室溫等離子誘變技術在絲孢酵母、釀酒酵母和粘紅酵母等方面的應用。利用ARTP誘變技術誘變絲孢酵母，對其遺傳物質產生損傷，引起細胞內的修復系統產生錯配位點，通過96孔板結合對硝基苯酚棕櫚酸酯高通量篩選，獲得具有穩定遺傳菌株[22]。通過等離子射流對酒釀酵母單細胞進行誘變處理，選擇致死率為90%～95%反復誘變，最終篩選出了1株比出發菌RNA產量提高了39%的遺傳穩定突變株[23]。通過從酵母菌中選育一株相對最高產的菌株進行ARTP處理，將其RNA的含量提高了160.54%[24]。研究產生油脂的粘紅酵母，通過在120 W常壓室溫等離子誘變30 s，粘紅酵母的基因序列受到破壞，經過發酵優化使其產脂量提高17.59%[25]。

4 ARTP在微藻誘變方面的應用

ARTP等離子誘變技術在微藻方面也具有普遍應用。研究ARTP等離子誘變對螺旋藻氨基酸含量的影響，經過ARTP等離子誘變技術選育出的螺旋藻突變菌株[26]。通過對油脂富含豐富的湛江等鞭金藻進行ARTP等離子誘變處理，得到了較原始菌株高產油脂的突變菌株，且可穩定遺傳[27]。蝦青素是一種具有強氧化力的類胡蘿卜素，具有延緩衰老、美白、提高人體自身抵抗力、抗癌的優點。吳曉英等人[28]通過ARTP技術在100 W的輸出功率，氣體流速10 L/min下處理40 S破壞其遺傳物質的結構，通過蝦青素合成抑制劑作為篩選劑，篩選出高產蝦青素比出發菌提高了52.96%的突變株。利用ARTP等離子誘變技術，經過選育得到最高產量較出發菌提高了33.85%的菌株，經過驗證該菌具有誘變作用且遺傳穩定。

5 結語

常壓室溫等離子誘變技術是通過其高密度的高活性粒子流，破壞細胞膜的通透性，導致遺傳物質的基因序列發生破裂，引發修復系統出現許多突變序列位點，再控制合適的輸出功率和時間等條件，可使出發菌株快速突變出現較高致死率，選育高產菌株。ARTP技術在微生物育種方面具有明顯的優勢，大大提高微生物在工業生產中應用效果。