鮮切西瓜水漬化損傷轉錄組測序分析

鄭雪夢，時 月，張 超，王雪敏

（1.河北工程大學，河北 邯鄲056006；2.北京市農林科學院 蔬菜研究中心，北京100097；3.果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，北京100097；4.農業農村部蔬菜產后處理重點實驗室，北京100097）

0 引言

鮮切西瓜是以新鮮西瓜為原料，經清洗、去皮、切塊和包裝等工序生產的即食果蔬制品，具有新鮮、營養、方便、無廢棄物等優點[1-3]。在歐美發達國家，鮮切西瓜是主要的消費形式，消費量占西瓜消費量的60%以上；在我國鮮切西瓜僅占西瓜總消費量的1%以下，主要供應于商超。目前，我國的鮮切西瓜產業正處于快速發展階段，有望在未來5年成為西瓜主要消費形式，但水漬化損傷阻礙鮮切西瓜產業的發展。

水漬化損傷的特征是果肉溶質泄漏增加，果肉顏色變深變軟[4]，常見于葫蘆科植物的果實。果實經鮮切處理后，組織發生應激反應，從而引起一系列的生理紊亂現象。研究表明，鮮切甜瓜呼吸速率增加，伴隨活性氧的積累，其能量水平提高，在貯藏過程中伴隨產生了較高的氧化應激和膜損傷[5]。鮮切西瓜水漬化損傷表現為果實顏色顯著增加，硬度顯著降低，口感和氣味均發生劣變，嚴重影響其商品性[2，6-7]。目前，關于西瓜水漬化損傷的研究都集中在外源乙烯誘導和1-MCP預防[8-11]，對果實硬度、相對電導率、磷脂酶、脂氧合酶活性進行測定，缺乏對果實分子代謝方面的研究。

隨著高通量測序平臺發展和西瓜全基因組測序完成，RNA-Seq已經成為了監測研究對象在各種環境條件下轉錄組水平的工具[12]。該技術通過對不同成熟期黃皮和綠皮西瓜樣品分析，明確了與西瓜果皮色澤相關差異基因[13]。通過對西瓜果實含糖量性狀QTL精細定位，明確西瓜果實糖分積累的相關機制[14]。該技術結合權重共表達網絡分析篩選出與乙烯信號通路及上游調控的關鍵基因，闡明西瓜成熟與乙烯調控的關系[15]。該技術通過對西瓜果實發育期的RNA樣品分析，明確了西瓜果肉硬度和果實有機酸積累的關鍵調控因子[16]，分析了西瓜抗裂果和感裂果的差異表達基因，為西瓜裂果的分子機理提供基因信息[17]。但是，關于鮮切西瓜貨架期內水漬化損傷的分子機制方面的還鮮有報道。

以京欣3號西瓜為材料，以未水漬化西瓜作為對照組，通過轉錄組測序分析水漬化果肉和未水漬化果肉的差異基因，探討鮮切西瓜水漬化損傷機制，挖掘出與水漬化相關的關鍵基因，為保持鮮切西瓜品質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

京欣3號西瓜，京研益農（北京）種業科技有限公司提供；選擇新鮮、果實大小適中、成熟度一致、無生理病害、無機械損傷的西瓜作為試驗材料。

1.2 鮮切西瓜處理方法

使用蒸餾水清洗西瓜表面灰塵，再使用150 μL/L次氯酸鈉溶液清洗2 min，蒸餾水漂洗2次，靜置瀝水。在超凈工作臺下，將西瓜縱向切開，去除果皮等不可食用部位，將果肉切割成邊長約3 cm的小果塊，混合均勻，裝入聚乙烯保鮮盒內，每盒約300 g，放置于4℃的冷藏柜中貯藏，觀察水漬化損傷情況。

京欣3號西瓜4℃貯藏表型鑒定見圖1。

圖1 京欣3號西瓜4℃貯藏表型鑒定

由圖1可知，貯藏第5天的鮮切京欣西瓜果肉呈現出明顯的水漬化現象，果肉顏色加深、果塊邊緣及瓜子周圍呈現水漬狀、果肉軟化。取冷藏5 d的西瓜果塊于無菌操作臺內分別取樣水漬化果肉和未水漬化果肉，液氮速凍，保存于-80℃冰箱，備用。以未水漬化果肉作為CK組，水漬化的果肉作為WS（water-soaking）組進行轉錄組測序，為確保轉錄組測序的準確性和可靠性，每個處理組作3次重復，分別標記為CK1，CK2，CK3，WS1，WS2和WS3。

1.2.1 總RNA提取、cDNA文庫構建和測序

采用TRIzol法提取組織中的總RNA，利用Nanodrop2000對所提RNA的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Agilent2100測定RIN值[18]。RNA檢測合格后，由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成轉錄組文庫構建、高通量測序和序列組裝工作。

1.2.2 測序數據

對各樣本的原始測序數據進行過濾，得到高質量的測序數據（clean data），與西瓜97103基因組進行序列比對，獲得用于后續轉錄本組裝、表達量計算等的mapped reads，同時對轉錄組測序的比對結果進行質量評估。使用軟件RSEM分別對基因和轉錄本的表達水平進行定量分析，定量指標為TPM（Transcripts Per Millionreads）。利用基于負二項分布模型的DESeq2軟件，以p-adjust＜0.05 &|log2FC|≥1為標準篩選差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）。

1.2.3 差異表達基因的GO功能注釋和KEGG富集分析

GO數據庫（Gene Ontology，基因本體數據庫）可將基因按照生物過程（Biological Process）、細胞組分（Cellular Componen）t和分子功能（Molecular Function）進行分類。

KEGG數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）可系統分析基因功能，將基因按照參與的pathway通路或行使的功能分類。

2 結果與分析

2.1 轉錄組數據質控分析

通過Illumina平臺對果肉樣本測序，使用SeqPrep和Sickle軟件對原始測序數據進行質控，測序結果顯示6個樣品共獲得48.53 Gb原始數據，通過過濾和質控后，共得到47.02 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均在7.16 Gb以上，測序堿基平均錯誤率均在0.025 3%以下，Q30堿基比例在93.89%以上，測序質量具有較高的可靠性，可用于下一步的分析。

西瓜果肉樣本轉錄組測序數據統計見表1，轉錄組測序數據與參考基因組比對結果統計見表2。

表1 西瓜果肉樣本轉錄組測序數據統計

分別將各樣品的過濾后讀長與西瓜97103基因組（Watermelon_97103）進行序列比對，表2顯示樣品比對率均大于74.00%，比對效率較高。測序質控和序列比對數據說明，6個樣本轉錄組測序數據質量較好，可以用于后續生物學分析。

表2 轉錄組測序數據與參考基因組比對結果統計

2.2 基因表達量分析

西瓜樣本關系分析見圖2。

圖2 西瓜樣本關系分析

通過相關性熱圖，對樣本間基因表達量的生物學重復相關性進行評估，將皮爾遜相關系數r作為評估指標，r2越接近1，說明2個重復樣品相關性越強。圖2（a）顯示每個樣本間的3次生物學重復的相關性較強，且對照組與水漬化組之間相關性較強，其中京欣西瓜水漬化樣本的3個組間重復相關性最好。同時，對6個樣本的基因表達量進行主成分分析，找出離群樣本，判別相似性高的樣品簇。如圖2（b）所示，相同處理的樣本之間聚集在一起，相似度較高，而不同處理之間基因表達差異顯著，分別形成不同的集群，與圖2（a）結果一致。

2.3 差異表達基因分析

利用基于負二項分布模型的DESeq2軟件，以p-adjust＜0.05 &|log2差異倍數|≥1為標準篩選差異表達基因。結果如表3所示，2組間共有491個基因差異表達，其中305個基因上調表達、186個基因下調表達。

差異基因表達量差異統計見表3。

表3 差異基因表達量差異統計/個

2.4 差異表達基因的GO功能注釋

差異表達基因的GO功能分類見圖3。

圖3 差異表達基因的GO功能分類

利用GO數據庫對差異表達的基因進行了GO功能注釋分類。上調基因主要注釋在催化活性、結合、代謝過程、細胞過程、膜部分、細胞部分、膜、生物調節條目。下調基因主要注釋在結合、代謝過程、催化活性、細胞過程、膜部分、細胞部分、膜、細胞器條目。

2.5 差異表達基因的KEGG富集分析

生物個體在行使其生物學功能時，往往需要不同層面的基因共同協調完成，通過對代謝通路的分析，可以更好地揭示差異表達基因的生物學功能。對京欣水漬化與京欣未水漬化的差異表達基因進行KEGG功能注釋，共注釋在代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環境信息處理（Environmental Information Processing）、細胞過程（Cellular Processes）、生物體系統（Organismal Systems）五大類別。

差異表達基因的KEGG功能分類見圖4。

圖4 差異表達基因的KEGG功能分類

上調基因主要注釋在碳水化合物代謝、脂質代謝、其他次生代謝產物的生物合成、信號轉導、氨基酸代謝、能量代謝、細胞生長與死亡、環境適應等通路。下調基因主要注釋在能量代謝、碳水化合物代謝、信號轉導、復制和修復、氨基酸代謝、環境適應、脂質代謝、其他氨基酸的代謝、核苷酸代謝、其他次生代謝產物的生物合成、膜運輸、細胞生長與死亡等通路。

差異表達基因的KEGG富集分析見圖5。

圖5 差異表達基因的KEGG富集分析

進一步對差異基因代謝通路進行顯著性富集分析。上調基因在角質、琥珀和蠟的生物合成、甘油脂代謝通路上顯著富集，在苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉化、類黃酮生物合成、光合生物中的碳固定、磷酸肌醇代謝、苯丙氨酸代謝、植物激素信號轉導、MAPK信號傳導途徑-植物、細胞衰老等通路也有較高富集。下調基因顯著富集在光合作用-天線蛋白、光合作用、DNA復制代謝通路上，在MAPK信號傳導途徑-植物、同源重組、糖酵解/糖異生、光合生物中的碳固定、磷酸戊糖途徑、細胞衰老等通路也有較高富集。

2.6 與水漬化損傷相關的候選基因篩選

與水漬化損傷有關差異基因的表達分析見表4。

由表4可知，篩選了可能與水漬化損傷有關的差異基因。

表4 與水漬化損傷有關差異基因的表達分析

果膠、半纖維素、纖維素是植物細胞壁的主要成分，決定了果實硬度。果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶是植物細胞壁降解的關鍵酶，參與藍莓[19]、梨[20]、甜瓜[21]、櫻桃[22]細胞壁降解，促進果實軟化。在研究中發現在水漬化西瓜中上調了果膠酯酶（Cla021324，Cla021325）、果膠裂解酶（Cla021445，Cla009870）、多半乳糖醛酸酶（Cla015246）基因的表達，促進西瓜果肉細胞壁降解、果肉硬度下降。

乙烯有促進器官脫落和衰老的作用，鈣參與維持細胞的動態形狀和細胞膜的完整性，鈣通過在果膠聚合物之間建立橋梁來穩定細胞壁。乙烯響應轉錄因子是植物中廣泛存在的一類轉錄因子，對植物的生長發育、次生代謝過程和植物的抗脅迫能力具有重要的調控作用[23]。鈣調蛋白可以調節細胞內鈣離子的濃度，介導細胞活動。發現2個乙烯響應轉錄因子（Cla021525，Cla007578）基因表達上調，一個鈣調蛋白（Cla012165）基因表達下調，參與信號轉導通路。

碳水化合物是生命細胞結構的主要成分及主要供能物質，并且有調節細胞活動的重要功能。磷酸果糖激酶是糖酵解作用的限速酶，丙酮酸是糖酵解途徑的最終產物，蔗糖合酶是植物糖代謝過程的關鍵酶，催化蔗糖的合成與分解。發現2個6-磷酸果糖激酶（Cla012643，Cla014418）、3個磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Cla000142，Cla002312，Cla023334）、1個蔗糖合酶基因（Cla018637）參與糖代謝過程。

磷脂雙分子層是構成細胞膜的的基本支架，磷脂酶在磷脂分解代謝中起重要作用，參與細胞膜代謝[24]。發現有2個磷脂酶（Cla020303，Cla009682）基因上調表達，參與細胞衰老。

3 結論

鮮切西瓜水漬化損傷是一個多基因參與、多種代謝過程相互影響的復雜過程，Mao L等人[10]發現50 μL/L外源乙烯處理的20℃貯藏的西瓜果實呈現水漬化狀，果實電導率、游離汁液增加、組織軟化，且經乙烯處理的西瓜中ACC合成酶、ACC氧化酶、磷脂酶C、磷脂酶D和脂氧合酶的活性明顯提高，推測西瓜果實的水漬化敗壞是一種由乙烯誘導的衰老現象。利用RNA-seq分析了鮮切京欣3號西瓜4℃貨架期貯藏5 d的水漬化果肉/未水漬化果肉的基因表達差異。與CK相比，水漬化樣本有305個上調基因和186個下調基因。差異基因GO注釋發現，差異表達基因主要注釋在代謝過程、細胞過程、催化活性、結合這4個GO條目，上調基因數目大于下調基因數目。差異基因KEGG注釋發現，差異基因主要富集在碳水化合物代謝、信號轉導、能量代謝、脂質代謝等途徑上。

碳水化合物是一類廣泛存在于植物體內的一類重要有機物，占植物干質量的50%以上，主要由植物進行光合作用產生。糖在生物體內經一系列的降解而釋放大量的能量供生命活動之需要。差異基因主要注釋在戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉化、糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、淀粉和蔗糖代謝通路，未水漬化損傷果肉中上調果糖激酶基因和蔗糖合酶基因的表達，促使6-磷酸果糖磷酸轉化，催化蔗糖合成和分解，生成更多能量，維持細胞生命活動。

成熟植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成。這些多糖化合物在果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶等細胞壁降解酶作用下分解，促進果實軟化。研究中發現，在水漬化西瓜中上調了果膠酯酶、果膠裂解酶、多半乳糖醛酸酶基因的表達。

植物激素信號轉導和MAPK信號傳導途徑-植物是差異基因富集的重要代謝通路。曹聲海[25]發現乙烯可能通過轉錄因子調節月季花朵衰老。鈣調蛋白能與鈣結合，調節細胞功能[26]。與CK相比，水漬化果肉上調了乙烯響應轉錄因子基因的表達，下調了鈣調蛋白基因的表達，促進細胞衰老。

磷脂酶在植物對環境的應答中都起著重要的作用,研究發現組織受傷或遭受病原侵染后，磷脂酶介導的磷脂快速水解反應在傷口處被激發[27]。與CK相比，水漬化果肉中磷脂酶基因上調表達，可能與細胞應對水漬化損傷相關。

目前，研究發現西瓜水漬化損傷與碳水化合物代謝、能量代謝、信號轉導、脂質代謝相關，研究結果從轉錄水平為解析鮮切西瓜水漬化的分子機理提供參考，為挖掘鮮切西瓜水漬化的關鍵功能基因提供基因資源。