臍血間充質干細胞外泌體對APP/PS1小鼠海馬神經元的保護作用及其機制

王涵，劉衛平，龍乾發，李俊辰，黑悅，劉宇琪，季丞

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種隱匿起病的進行性神經退行性疾病，目前機制尚不清楚；雖然在AD的研究方面已投入巨大，但仍然缺乏有效的預防及治療措施[1-2]。間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有抗炎、免疫調節、血管生成、清除病理蛋白以及基質重構等功能[3]。而間充質干細胞外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosome,MSC-EXO)不僅具有與間充質干細胞相似的功能，并且具有更好的安全性[4]。本研究以APP/PS1小鼠作為AD的疾病模型，給予尾靜脈注射MSC-EXO處理，通過免疫組織化學染色觀察小鼠腦內淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的沉積，并通過Nissl染色觀察海馬組織的神經元數量；并對NF-E2相關因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)及血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)蛋白的表達水平進行檢測；以探討MSC-EXO對海馬神經細胞的保護作用及其機制，為AD的治療提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級APP/PS1雄性小鼠以及年齡匹配的野生型C57BL/6小鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006)，飼養于空軍軍醫大學動物中心，生產許可證號：SCXK(陜)2019-001；小鼠在12∶12白晝交替的環境中自由飲食飲水。本研究方案得到空軍軍醫大學動物倫理委員會的批準。

1.1.2 主要試劑 間充質干細胞專用培養基(友康恒業生物科技有限公司)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma，D9542-10MG)；兔抗ACTB(Abclonal，AC026)；兔抗Nrf2(Abmart，T55136S)；兔抗keap1(Proteintech，10503-2-AP)；兔抗HO-1(Proteintech，10701-1-AP)；6e10抗體(Biolegend，SIG-39320)；辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠(Thermo Fisher Scientific，A16078)，辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔(Thermo Fisher Scientific，A16096)，CD9單克隆抗體(Abcam，ab92726)；TSG101單克隆抗體(Abcam，ab125011)；Alexa FlourTM 594 C5 Maleimide(Invitrogen，A10256)。

1.2 方法

1.2.1 MSC培養及外泌體(exosome,EXO)分離、鑒定 本課題組前期已形成成熟的MSC培養和EXO分離與鑒定的方法[5]。使用干細胞專用培養基培養間充質干細胞，細胞融合至80%時，更換無血清培養基繼續培養24～48 h，收集細胞上清，于-80 ℃凍存備用，或者直接進行EXO的分離。采用超速離心法在4 ℃下進行EXO的分離，依次300 g/min離心10 min、2 000 g/min離心10 min、10 000 g/min離心20 min去除細胞及細胞碎片，100 000 g/min離心70 min得沉淀，PBS重懸；再次100 000 g/min離心70 min，沉淀以100 μL PBS重懸，-80 ℃保存。采用蛋白質免疫印跡法檢測EXO的表面標志物CD9和TSG101，電子顯微鏡(電鏡)觀察EXO的形態。

1.2.2 EXO的標記與示蹤 按本課題組前期研究的方法[6]。將Alexa FlourTM594 C5 Maleimide加入EXO懸液中，避光常溫孵育1 h；EXO旋轉柱(MW3000,Invitrogen)中的樹脂粉末在常溫下水化15～30 min，離心去除多余的水分，將旋轉柱放入1.5 mL離心管中，孵育完畢的EXO加入樹脂中，750 g離心5 min，收集標記的MSC-EXO。將標記的MSC-EXO通過尾靜脈注射入APP/PS1小鼠體內，24 h后麻醉小鼠，灌注取腦固定，行免疫熒光染色，用共聚焦顯微鏡對小鼠大腦切片進行觀察拍照。

1.2.3 動物分組及處理 將20只培養至9個月大的APP/PS1小鼠隨機分為模型組(AD+saline)和治療組(AD+EXO)，每組10只；將年齡匹配的10只野生型c57小鼠作為正常對照組。治療組小鼠通過尾靜脈注射50 μg/150 μL EXO懸液，AD+ saline組和對照組小鼠注射等體積的生理鹽水。30 d后，每組4只小鼠直接取海馬組織做免疫印跡實驗，每組3只小鼠4%多聚甲醛灌注后取海馬行免疫組化染色，每組3只小鼠取海馬用4%戊二醛固定后電鏡下觀察。

1.2.4 蛋白質免疫印跡法 3組小鼠在注射EXO或生理鹽水后30 d處死，于冰上快速剝離海馬組織，加入RIPA裂解液，超聲裂解后，12 000 r/min離心10 min，取上清液進行BCA定量，然后加入上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min，制備蛋白樣品。10%瓊脂糖凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，300 mA 恒流轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST緩沖液洗膜，4 ℃下一抗孵育過夜；次日復溫1 h，TBST洗膜，常溫下二抗孵育2 h，加入發光液于發光儀中曝光。用Image Lab分析條帶。

1.2.5 免疫組化和免疫熒光染色 小鼠麻醉后用4%多聚甲醛灌注，剝離腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片(厚度4～10 μm)。將切片依次浸入二甲苯及梯度乙醇中進行脫蠟和水化；之后放入枸櫞酸緩沖液中沸水浴100 s進行抗原修復；在3%的過氧化氫溶液中室溫孵育30 min，TBS沖洗3次；二抗來源的血清室溫下封閉1 h，加一抗在濕盒中孵育過夜；次日用TBS沖洗切片，室溫下孵育二抗2 h(免疫組化用HRP偶聯的二抗，免疫熒光用Alex 488偶聯的二抗)。免疫組化染色：二抗洗滌后，DAB顯色，自來水終止；蘇木素復染30～60 s，水洗后用1%鹽酸乙醇分化，自來水返藍，脫水固定封片。免疫熒光染色：二抗洗滌后，DAPI染色10 min，洗滌后，封片。在顯微鏡下觀察切片，并采集圖像。

1.2.6 透射電鏡觀察 取腦剝離海馬組織，浸泡在4%戊二醛固定液中將海馬切成組織塊(1 mm×1 mm×2 mm)，繼續在4%戊二醛溶液中固定24 h，PBS緩沖液沖洗；1%鋨酸中后固定，漂洗；梯度乙醇及丙酮脫水；依次使用不同比例的丙酮與包埋劑進行滲透；使用812樹脂進行包埋，將包埋板放入恒溫干燥箱中37 ℃ 4 h、45 ℃ 6 h、60 ℃ 12 h依次干燥后，進行超薄切片，片厚50～100 nm；醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛分別染色30 min、10 min，蒸餾水漂洗，干燥，電鏡下觀察。

1.2.7 尼氏染色(Nissl staining) 取材及石蠟包埋、切片等步驟同上。石蠟切片依次在二甲苯和梯度乙醇中脫蠟和水化，用1%焦油紫溶液染色20 min，蒸餾水清洗切片，用70%乙醇分色，之后梯度乙醇脫水，固定封片，顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 間充質干細胞及EXO鑒定、示蹤 流式細胞儀檢測培養的間充質干細胞的表面標志，發現其高表達干細胞及基質細胞標記CD29、CD90、CD44，陽性率均在90%以上，低表達造血干細胞及內皮細胞標志CD34和CD45，陽性率均低于2%(圖1)。免疫印跡檢測結果顯示，EXO表面標志蛋白TSG101、CD9呈陽性；電鏡觀察MSC-EXO為類圓形雙層膜囊泡狀結構，呈盤狀或茶托狀，膜結構完整，直徑在30～150 nm之間，具有EXO的典型特性。對給予A549標記EXO的小鼠腦組織進行NeuN免疫熒光染色，電鏡下被NeuN標記的神經元為綠色。結果顯示，海馬區神經元中出現紅色熒光，表明MSC-EXO經尾靜脈注射后，可通過血-腦屏障進入海馬神經元。

A: MSC表面標志物鑒定；B:免疫印跡檢測MSC-EXO特異性表面標記CD9和TSG101；C: 電鏡觀察MSC-EXO(×43 000)；D:MSC-EXO示蹤(NeuN免疫熒光染色，×400)

2.2 3組小鼠海馬及皮層的Aβ陽性面積 免疫組化染色后細胞核為藍色，神經元內或胞外組織間隙中存在的棕黃色或棕褐色顆粒及斑塊即為Aβ免疫染色陽性反應。結果顯示，AD+saline組小鼠海馬及皮層的Aβ陽性面積比對照組小鼠明顯增多，AD+EXO組小鼠海馬及皮層的Aβ陽性面積較AD+saline組小鼠減少(圖2)。

A、B、C：免疫組化染色×40；D、E、F：免疫組化染色×100

2.3 3組小鼠海馬DG區神經元數量比較 見圖3。Nissl染色顯示，對照組小鼠海馬DG區神經元排列整齊均勻，胞內尼氏小體豐富，未見明顯的神經元缺失。AD+saline組小鼠海馬DG區的神經元數量減少，胞內尼氏小體大量脫失；DG區細胞層厚度與對照組相比顯著減小(P<0.01)。AD+EXO組小鼠海馬DG區的神經元數量較AD+saline組增多，DG區細胞層厚度與AD+saline組相比顯著增厚(P<0.05)。

A：神經元的形態和數量(Nissl染色，×30，×400)；B:細胞層厚度比較(*與AD+saline組比較P<0.05；**與對照組比較P<0.01)

2.4 3組小鼠海馬神經元線粒體的改變 與對照組小鼠相比，AD+saline組小鼠海馬神經元的線粒體出現腫脹、空泡化、嵴結構改變等現象；而AD+EXO組小鼠海馬神經元的線粒體僅有輕微腫脹，嵴結構也近乎正常(圖4)。

A、B、C：×8 200；D、E、F：×16 500) A：蛋白免疫印跡實驗；B：蛋白表達水平半定量分析

2.5 3組小鼠海馬Nrf2、Keap1及HO-1表達量比較 見圖5。與對照組相比，AD+ saline組小鼠海馬組織的Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著升高，而Keap1表達量顯著降低(均P<0.05)。與AD+saline組相比，AD+EXO組小鼠海馬組織的Nrf2、HO-1蛋白表達量顯著降低，而Keap1表達量顯著升高(均P<0.05)。

3 討 論

AD是以認知障礙、記憶障礙、人格和行為改變為主要臨床表現的中樞神經系統退行性疾病[7]，已被世界衛生組織認定為全球公共衛生重點疾病。據報道，1990年至今中國AD的患病率約為3.4%，預計到2050年中國AD患者將達到2010年的2.52倍。目前AD的治療以對癥處理為主[8]，但臨床效果不佳，亟待研發新的治療思路和手段。

隨著再生醫學的發展，間充質干細胞越來越受到重視，因其不僅有免疫原性低、成瘤性低的特性，還能發揮免疫調節、抗炎作用，且具有多向分化潛能，可以預見其在治療AD方面有著良好的前景[9-13]。研究表明，間充質干細胞通過旁分泌的方式發揮作用[14]，可分泌包括生長因子、集落刺激因子、神經源性營養因子在內的多種生物活性物質。EXO作為細胞分泌的囊泡狀結構，不僅攜帶有豐富的生物活性物質等，無成瘤風險，更易保存和運輸，在多種神經退行性疾病的治療研究中已顯現出很好的療效[15,16]，但在AD的治療應用研究報道較少。

目前的研究報道，AD的發病原因除了比較公認的Aβ蛋白的生成和代謝紊亂假說之外，Tau蛋白異常磷酸化、氧化應激和自由基損傷、神經炎癥、膽堿能假說等也在AD的發生發展中起到了十分重要的作用[17-18]。本研究主要針對AD的Aβ異常堆積的病理機制及氧化應激和自由基損傷假說進行探討。

本研究采用免疫組化技術對APP/PS1小鼠腦內的Aβ沉淀進行檢測，結果顯示經MSC-EXO處理后AD小鼠腦內的Aβ沉積明顯減少；表明MSC-EXO減少了Aβ蛋白在小鼠腦內的聚集。并采用尼氏染色對3組小鼠海馬DG區神經元進行觀察，顯示與對照組相比，AD+saline組小鼠海馬DG區神經元尼氏小體大量缺失，神經元密度明顯降低，而AD+EXO組小鼠海馬DG區神經元則缺失明顯減少。這與本研究前期的實驗結果，即MSCs-EXO可以靶向修復神經元并促進損傷腦組織中的神經元再生[19]相一致；最近的研究結果也證實了這一點[20]。這些研究結果表明MSCs-EXO可能在AD早期發揮延緩發病的作用。

在AD發病過程中，氧化應激作為發病中的關鍵一環，可導致神經元突觸膜及樹突棘的氧化損傷，影響突觸可塑性，進而導致認知功能障礙。氧化損傷還會導致包括能量代謝在內的多種生理過程的酶活性的改變，造成神經元損傷。Nrf2/Keap1是重要的氧化應激信號調節通路，在維持體內的氧化物和過氧化物平衡方面發揮著十分重要的作用[21]。前期研究已證明，在癲癇小鼠模型中MSC-EXO可以改善炎癥誘導的星形膠質細胞轉化；此過程就涉及了Nrf2/Keap1通路[5]。本研究發現MSC-EXO可調控氧化應激相關Nrf2/Keap1信號通路；推測MSC-EXO可能是通過調控Nrf2/Keap1信號通路影響線粒體氧化應激，以達到改善神經元和認知功能的作用。

此外，氧化應激會損傷線粒體膜，造成線粒體的形態損傷和功能失調。線粒體級聯損傷在AD發病過程中也發揮著十分重要的作用[22]。本研究通過電鏡觀察發現，AD+saline組小鼠海馬神經元線粒體有明顯損傷，而經EXO處理的AD+EXO組小鼠海馬神經元線粒體損傷則明顯減輕。這也進一步佐證了MSC-EXO可能通過改善氧化損傷發揮治療作用。

總之，本研究結果表明MSC-EXO在修復AD的神經元損傷方面有良好的效果；因此，MSC-EXO未來可能為AD的臨床治療提供新的途徑。