PTEN表達對惡性腦膠質瘤細胞放射敏感性的影響及其機制研究

李欣欣，楊永輝，李京，任秉輝，王輝，朱雁冰

惡性腦膠質瘤是臨床上常見的顱腦腫瘤，其占顱腦腫瘤的比例高達60%[1]，主要以浸潤性方式生長，與腦組織無明確分界，通過手術難以徹底切除；并且擴散速度快，復發性高。目前，手術切除后聯合放療是惡性腦膠質瘤極為重要的治療方法，但大部分腦膠質瘤對放療不敏感，導致治療效果仍不理想[2]。因此，增強惡性腦膠質瘤的放射敏感性成為了優化治療，改善患者預后的一個重要途徑。近年來研究發現，第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一種具有磷酸酶活性的腫瘤抑制因子，在各種腫瘤的發生發展中發揮作用[3]。目前研究發現，PTEN在肺癌、晚期乳腺癌、晚期結直腸癌中均異常表達[4-5]。另外有研究顯示，PTEN失活及survivin高表達是胃癌發展及預后的關鍵因素[6]；中華龍膽總黃酮通過PI3K/AKT/PTEN信號通路誘導肝癌細胞凋亡[7]。然而，PTEN對惡性腦膠質瘤放射敏感性的影響目前尚不清楚。為此，本研究采用細胞實驗方法探討PTEN對惡性腦膠質瘤放射敏感性的影響及其機制，以進一步闡明PTEN在惡性腦膠質瘤T98G細胞中的關鍵作用。

1 材料與方法

1.1 材料 惡性腦膠質瘤組織(20例)以及距病變部位≥2 cm的癌旁正常組織標本(10例)來自開灤總醫院；采集的標本經過患者和家屬同意，保存在液氮中備用。惡性腦膠質瘤U251細胞和T98G細胞，正常腦膠質HEB細胞(上海中國科學院細胞庫)；DMEM(Dulbecco’s-modified Eagle’s medium)培養基，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和LipofectamineTM2000(大連Takara公司)；PI3K抑制劑LY294002、AKT抑制劑CCT128930(美國Selleck生物科技公司)；PI3-kinase p110γ抗體，GAPDH多克隆抗體(上海圣克魯斯生物公司)；Anti-pan-AKT，Anti-GSK3β抗體(英國abcam公司)；siRNA NC，PTEN siRNA，pcDNA-PTEN質粒(北京擎科生物有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 在含10% FBS的DMEM培養基中培養U251細胞、T98G細胞和HEB細胞，于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養。當細胞匯合度約為90%時，用0.25%的胰蛋白酶進行傳代培養。取處于對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞轉染 取處于對數生長期的細胞鋪于12孔板中，細胞匯合至75%～80%時，將培養基更換成無血清培養基；用無FBS培養基稀釋各組重組質粒和LipofectamineTM2000，將稀釋后的重組質粒和脂質體混勻，室溫孵育20 min；將混合物滴加到細胞中，或轉染重組質粒后，采用0、2、4、6 Gy的X線垂直照射細胞，所用劑量率為3 Gy/min；48 h后收集各組細胞RNA和蛋白進行生物學功能實驗。

1.2.3 細胞增殖測定 取處于對數生長期的細胞，用胰蛋白酶消化細胞制成細胞懸液，接種于96孔板中；細胞匯合達70%～80%時，使用LipofectamineTM2000轉染質粒，或轉染后用6 Gy X線照射細胞，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h后棄上清，每孔加入10 μL濃度為5 mg/mL的四甲基偶氮唑鹽(tetramethylazozolium salt，MTT)溶液；孵育4 h后去上清，加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)終止反應，用酶標儀讀取490 nm處每孔細胞的吸光度值。

1.2.4 細胞侵襲實驗 將-20 ℃保存的matrigel置于4 ℃融化，用無FBS DMEM培養基稀釋matrigel濃度為1 mg/mL。每個上室中加入100 μL稀釋后的matrigel，室溫孵育干成膠狀。細胞匯合達95%時，用6 Gy X線照射細胞，0.25%的胰酶消化后，用無FBS的DMEM培養基稀釋為細胞懸液，加入Transwell小室中；下室中加入完全培養基，37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色20 min，在顯微鏡下選取5個視野細胞觀察并計數。

1.2.5 細胞凋亡率檢測 用LipofectamineTM2000轉染試劑將各組重組質粒轉染至T98G細胞，用6 Gy X線照射細胞，0.25%胰酶消化后，用完全培養基進行中和，1 000 r/min離心15 min，棄上清。將沉淀置于70%的乙醇中，4 ℃固定過夜，采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡水平。

1.2.6 PTEN mRNA表達量檢測 采用實時熒光定量PCR方法。將惡性腦膠質瘤組織和癌旁組織從液氮中取出，加入液氮進行研磨，破碎后按RNA提取試劑盒說明書的步驟提取各組織中總RNA。取各對數生長期的惡性腦膠質瘤細胞，使用Trizol提取細胞RNA。用Nanodrop檢測總RNA的濃度和純度，使用Takara反轉錄試劑盒反轉成cDNA，逆轉錄得到的cDNA為模板，進行RT-qPCR；反應程序為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環；用2-△△Ct法分析實驗結果。實驗所用的引物為：GAPDH-F：CAAGGACCTCTACGCCAACAC；GAPDH-R：TGGAGGCGCGATGATCTT；PTEN-F：CACAGA-ATTCCAGACATGACAGCCATCATC；PTEN-R：GTG-GATCCTCATGGTGTTTTATCCCTCTTG。

1.2.7 PTEN蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。從液氮中取出腫瘤組織和癌旁組織剪碎，加入RIPA裂解液后研磨成組織勻漿，從組織蛋白中提取總蛋白。T98G細胞根據提取蛋白說明書提取總蛋白，使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度，取適量樣品進行點樣，以5%的濃縮膠、12%的分離膠進行電泳，結束后采用濕轉將蛋白濕轉到PVDF膜上。用50 g/L脫脂奶粉配制封閉液，將膜置于封閉液中在搖床上室溫封閉120 min。加入一抗在4 ℃下過夜反應，TBST清洗5次，每次5 min，再與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，采用ECL法進行蛋白顯影。

2 結 果

2.1 惡性腦膠質瘤組織和細胞的PTEN表達量 惡性腦膠質瘤組織的PTEN mRNA和蛋白表達量明顯低于瘤旁正常組織(均P<0.01)(圖1A-C)。腦膠質瘤U251細胞和T98G細胞的PTEN mRNA和蛋白表達量明顯低于正常腦膠質HEB細胞(P<0.05～0.01)，且在惡性腦膠質瘤T98G細胞中的表達量最低(P<0.01)(圖1D-F)。因此選擇惡性腦膠質瘤T98G細胞用于后續實驗。

A：惡性腦膠質瘤與癌旁正常組織的PTEN mRNA表達量比較；B：惡性腦膠質瘤與癌旁正常組織的PTEN蛋白表達水平檢測；C：惡性腦膠質瘤與癌旁正常組織的PTEN蛋白表達水平比較；D：HEB、U251和T98G細胞的PTEN mRNA表達量比較；E：HEB、U251和T98G細胞的PTEN蛋白表達水平檢測；F：HEB、U251和T98G細胞的PTEN蛋白表達水平比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.2 不同劑量X線照射T98G細胞的PTEN表達量比較 2 Gy、4 Gy、6 Gy X線照射T98G細胞的PTEN mRNA和蛋白表達量明顯高于無X線照射(0 Gy)T98G細胞(P<0.05～0.001)；并且隨X線照射劑量增高，T98G細胞的PTEN表達量亦升高。見圖2。

A：不同劑量X線照射T98G細胞的PTEN mRNA表達量比較；B：不同劑量X線照射T98G細胞PTEN蛋白表達水平檢測；C：不同劑量X線照射T98G細胞的PTEN蛋白表達水平比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.3 過表達PTEN對T98G細胞放射敏感性的影響 與pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-PTEN組和pcDNA-3.1(+)+6 Gy組細胞的PTEN mRNA表達量均明顯升高(P<0.001，P<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+6 Gy組相比，pcDNA-PTEN+6 Gy組細胞的PTEN mRNA表達量明顯升高(P<0.001)(圖3A)。與pcDNA-3.1(+)組相比，pcDNA-PTEN組和pcDNA-3.1(+)+6 Gy組T98G細胞活力明顯下降、細胞侵襲數明顯減少、細胞凋亡率明顯增高(P<0.05～0.01)；與pcDNA-3.1(+)+6 Gy組相比，pcDNA-PTEN+6 Gy組T98G細胞活力下降、細胞侵襲數明顯減少、細胞凋亡率明顯增高(P<0.05～0.01)(圖3B-F)。

A：各組細胞的PTEN mRNA表達量比較；B：各組細胞的生長活性比較；C：各組細胞侵襲實驗的結果(結晶紫染色，×200)；D：各組細胞侵襲數比較；E：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡數；F：各組細胞的凋亡率比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.4 下調PTEN對T98G細胞放射敏感性的影響 PTEN siRNA組T98G細胞的PTEN mRNA表達量顯著低于siRNA NC組，siRNA+6 Gy組細胞的PTEN mRNA表達量明顯高于siRNA NC組和PTEN siRNA+6 Gy組(均P<0.01)(圖4A)。與siRNA NC組相比，PTEN siRNA組T98G細胞活力明顯升高、細胞侵襲數明顯增加、細胞凋亡率明顯降低(P<0.05～0.01)，siRNA+6 Gy組T98G細胞活力明顯降低、細胞侵襲數明顯減少、細胞凋亡率明顯升高(P<0.05～0.01)；與siRNA+6 Gy組相比，PTEN siRNA+6 Gy組T98G細胞活力升高、細胞侵襲數明顯增加、細胞凋亡率明顯降低(P<0.05～0.01)(圖4B-F)。

A：各組細胞的PTEN mRNA表達量比較；B：各組細胞的生長活性比較；C：各組細胞侵襲實驗結果(結晶紫染色，×200)；D：各組細胞的侵襲數比較；E：流式細胞儀檢測各組細胞凋亡數；F：各組細胞的凋亡率比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.5 敲低PTEN對T98G細胞PI3K-AKT-GSK3β信號通路的影響 PTEN siRNA組細胞的PTEN mRNA表達量明顯低于siRNA NC組(P<0.01)(圖5A)。與siRNA NC組相比，PTEN siRNA組細胞PI3K、AKT和GSK3β蛋白的磷酸化水平以及p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著升高(P<0.05～0.01)(圖5B-C)。用PI3K抑制劑LY294002預處理細胞后，阻斷了敲低PTEN誘導的AKT磷酸化；用AKT抑制劑CCT128930預處理細胞后，阻斷了敲低PTEN誘導的GSK3β磷酸化(圖5D-G)；表明AKT作用于PI3K的下游，而GSK3β作用于AKT的下游。

A：PTEN siRNA組與siRNA NC組細胞PTEN mRNA表達量比較；B：兩組細胞的PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達量；C：兩組細胞的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β表達水平比較；D：LY294002處理組及PTEN siRNA組、siRNA NC組細胞的AKT、p-AKT蛋白表達量；E：3組細胞的p-AKT/AKT表達水平比較；F：CCT128930處理組及PTEN siRNA組、siRNA NC組細胞的GSK3β、p-GSK3β蛋白表達量；G：3組細胞的p-GSK3β/GSK3β表達水平比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.6 敲低PTEN激活PI3K-AKT-GSK3β信號通路對T98G細胞放射敏感性的影響 與siRNA NC組相比，PTEN siRNA組細胞的PTEN mRNA表達量明顯下降，siRNA NC+6 Gy組細胞的PTEN mRNA表達量明顯升高(均P<0.01)；與siRNA NC+6 Gy組相比，PTEN siRNA+6 Gy組細胞的PTEN mRNA表達量明顯下降(P<0.01)(圖6A)。與siRNA NC組相比，PTEN siRNA組細胞活力明顯上升、細胞侵襲數明顯增多、細胞凋亡率降低(P<0.05～0.01)，siRNA NC+6 Gy組細胞活力下降、細胞侵襲數減少、細胞凋亡率增高(P<0.05～0.01)；與siRNA NC+6 Gy組相比，PTEN siRNA+6 Gy組細胞活力上升、細胞侵襲數增多、細胞凋亡率降低(P<0.05～0.01)；與PTEN siRNA+6 Gy組相比，PTEN siRNA+6 Gy+LY294002組細胞活力降低、細胞侵襲數減少、細胞凋亡率增高(均P<0.05)(圖6B-F)。結果表明敲低PTEN激活PI3K-AKT-GSK3β信號通路影響T98G細胞的放射敏感性。

A：各組細胞PTEN mRNA表達量比較；B：各組細胞的生長活性比較；C：各組細胞侵襲實驗結果(結晶紫染色，×200)；D：各組細胞侵襲數比較；E：流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡數；F：各組細胞的凋亡率比較(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

3 討 論

近年來惡性腦膠質瘤的發病率不斷上升，患者的預后不良，嚴重影響著生命健康。因此深入探討惡性腦膠質瘤的致病機制具有重要意義。PTEN是具有蛋白磷酸酶活性和脂質磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，并通過其雙特異性磷酸酶活性調控多種信號途徑，進而調控各種細胞的生命進程。研究發現，PTEN在腫瘤的形成中起重要作用，在多種腫瘤組織中表達異常，另外在腫瘤組織中常出現缺失或突變。如有研究顯示，在食管癌患者中PTEN表達下調[8]，在原位癌和外陰鱗狀細胞癌中PTEN發生了突變[9]，在腎癌、乳腺癌、腦癌和胰腺導管腺癌等癌癥中出現缺失或突變[10-12]。本研究分析了惡性腦膠質瘤的PTEN mRNA和蛋白表達水平，實驗結果顯示，惡性腦膠質瘤組織和T98G細胞的PTEN mRNA和蛋白表達顯著下調，表明PTEN的異常表達與惡性腦膠質瘤的發生具有相關性。

由于晚期惡性腦膠質瘤患者對放射治療不敏感，對患者預后產生嚴重影響；因此，提高惡性腦膠質瘤對放射治療的敏感性至關重要。研究表明，細胞內基因調控的DNA損傷修復、細胞凋亡和細胞增殖等過程與放射敏感性密切相關；基因多態性及基因變異等都與放射敏感性相關[13-14]。PTEN負調控細胞周期和多種信號途徑，能夠抑制細胞的遷移、分化、衰老及凋亡等多種生理活動。研究發現，抑癌基因PTEN誘導膀胱癌細胞的凋亡與其脂質磷酸酶抑制AKT的磷酸化有關[15]；在結直腸癌中，TRIM14通過抑制PTEN促進細胞增殖及抑制細胞凋亡[16]。最近研究發現，敲除PTEN在乳腺、皮膚及前列腺等多組織器官中的表達會引起腫瘤形成[17]。此外，miR-548-3p通過核因子活化B細胞的Κ輕鏈增強子(nuclear factor-Κ-gene binding，NF-kB)靶向PTEN增加非小細胞肺癌的侵襲性[18]。本研究結果顯示，惡性腦膠質瘤細胞經X線照射后，PTEN mRNA和蛋白表達量顯著升高，呈現出照射劑量依賴性。因PTEN是腫瘤抑制基因，在癌細胞內的表達量較低；而惡性腦膠質瘤細胞經X線照射后細胞活力明顯降低，腫瘤細胞受到刺激后可能促使PTEN表達量明顯升高，進一步發揮腫瘤抑制作用。過表達PTEN的T98G細胞經X線照射后，其活力明顯下降、細胞侵襲數減少及細胞凋亡率增高；而用siRNA技術下調PTEN表達的T98G細胞行X線照射后，細胞活力明顯上升、細胞侵襲數增多及細胞凋亡率減低。結果表明，過表達PTEN能夠增強T98G細胞的放射敏感性，而下調PTEN能夠降低細胞的放射敏感性。

Alzahrani研究證實，PTEN失活能夠激活PI3K-AKT信號通路；而活化的PI3K-AKT信號通路參與了細胞增殖、細胞凋亡、調控內皮生長和血管生成等生物學進程[19]。如Yoon等研究發現，紅皮蓮干果中的甲基lucidone通過抑制PI3K/AKT通路，引起卵巢癌細胞G2/M期阻滯和凋亡[20]。還有研究報道，非瑟酮通過調控PI3K/AKT/mTOR通路發揮對乳腺癌細胞的抗癌作用[21]。本研究顯示，敲低惡性腦膠質瘤細胞的PTEN表達并行X線照射后，激活了細胞的PI3K-AKT-GSK3β信號通路，而且該信號通路介導了敲低PTEN對惡性腦膠質瘤放射敏感性的影響。結果表明，沉默PTEN能夠通過激活PI3K-AKT-GSK3β信號通路影響惡性腦膠質瘤細胞的放射敏感性。有研究報道，腫瘤組織和細胞內含有高水平的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，有利于維持腫瘤細胞的惡性表型；而敲低PTEN表達后，降低了ROS對AKT通路的阻斷，而使PKB/AKT通路保持一個高活化狀態，抵抗ROS誘導的細胞凋亡，進一步使腫瘤細胞的放射敏感性降低[22]。本研究的結果與其一致，表明在惡性腦膠質瘤細胞中，PTEN也是通過PI3K-AKT-GSK3β通路影響腫瘤細胞的放射敏感性；推測其作用機制也可能與細胞的ROS水平有關，但具體機制還需要進一步深入研究。

綜上所述，PTEN在惡性腦膠質瘤中起抑癌作用，沉默PTEN能夠通過激活PI3K-AKT-GSK3β信號通路影響惡性腦膠質瘤細胞的放射敏感性。本研究結果表明，PTEN/PI3K-AKT-GSK3β軸可能成為增強惡性腦膠質瘤患者放射敏感性的重要靶點。