miR-93在腦膠質瘤的表達及其對膠質瘤細胞系U87、U251細胞增殖的影響

朱瀟鵬，陳澤波，范宏軍，李甘，黃永凱，韓德清

腦膠質瘤起源于神經外胚層，約占神經上皮腫瘤的60%，是最常見的原發性顱內腫瘤[1]。其中多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的惡性程度最高，即使手術全切除聯合放療、化療等綜合治療，患者的中位生存期僅有12～14個月[2]。高級別腦膠質瘤是指WHO Ⅲ-Ⅳ的膠質瘤，腫瘤呈浸潤性生長，與瘤周組織分界不清，難以達到手術全切。殘余的腫瘤細胞加上其強增殖、強侵襲、新生血管豐富等特點，患者總體預后不佳[3]。當前大量研究從分子遺傳水平探索腦膠質瘤發生、發展的分子機制，以期針對關鍵的腫瘤驅動因素進行靶向治療，從而提高患者的治療效果。

microRNAs(miRNAs)是一類內源性、保守長度為20-24nt的非編碼小分子RNA，廣泛存在于哺乳動物中，參與細胞的增殖、分化、遷移等生理過程[4]。大量的研究證實miRNA與腫瘤的發生發展、惡性程度、患者的預后密切相關。課題組前期選用microRNA組織芯片對WHO Ⅱ-Ⅲ級腦膠質瘤組織和配對瘤周組織的1 924個microRNA分子的表達情況進行分析發現；分析的1 924個microRNA分子中13個表達異常，上調的microRNA分子12個，下調的1個；與瘤周組織相比，腦膠質瘤中miR-93分子呈現異常的高表達[5]。考慮到芯片檢測存在一定假陽性率，芯片結果需進一步驗證。本研究，通過收集61例不同級別的膠質瘤組織，運用qRT-PCT技術，驗證miR-93在膠質瘤組織中的表達情況。并進一步設計實驗，探討miR-93在膠質瘤細胞系中的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 一般資料 本組患者中男37例，女24例；WHO Ⅰ-Ⅳ級的患者分別：5例、21例、15例和20例。病理診斷由中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院病理科2名正/副主任醫師根據2016版《WHO中樞神經系統腫瘤分類》診斷并進行分型。患者或家屬知情同意。用于對照的亞洲人正常大腦總RNA預混合物購自美國Clontech公司。

1.2 細胞培養及miRNA抑制物轉染 膠質瘤細胞系U87、U251在DMEM培養基中培養，培養基含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。構建慢病毒干擾載體(紐恩生物科技有限公司)，轉染時取對數期生長的U87和U251細胞，以2×105個/孔接種于6孔板，待80%細胞匯合后，按照說明書轉染。熒光顯微鏡下觀察是否轉染成功，qRT-PCR檢測轉染后的miRNA的表達情況。將膠質瘤細胞(U87和U251)分為3組：(1)空白對照組(miR-93)，U87、U251培養基中加入等量生理鹽水；(2)陰性對照組(NC)，U87、U251培養基中加入空白病毒載體；(3)轉染miR-93抑制物組(miR-93 RNAi)，U87、U251培養基中加入miR-93病毒干擾載體。

1.3 膠質瘤組織及細胞中miR-93的表達檢測 將收集的膠質瘤組織和U87、U251腫瘤細胞按照TRIzol試劑盒說明書(重慶川東化工公司)提取組織和細胞的總RNA。然后測定所提總RNA樣品在280 nm的光密度(D)值并定量。使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，并使用SYBR green one 進行定量PCR。PCR的擴增參數：95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s，共40個循環。miR-93正向引物序列為 5′-AGGCCCAAAGTGCTGTTCGT-3′，反向引物序列為: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6作為miR-93的內參基因，進行3次獨立實驗。并使用△△CT方法分析基因的相對表達量，目標量=2-△△CT。

1.4 細胞增殖實驗 取不同分組(空白對照組、陰性對照組、轉染miR-93抑制物組)U87和U251對數生長期的細胞，以1×103/孔接種到96孔中，設置4個復孔；用完全DMEM培養基于37 ℃ 5% CO2培養箱內繼續培養24 h、48 h、72 h、96 h后，采用cell counting Kit-8(CCK-8)檢測細胞的增殖情況。即每孔加入10 μL CCK-8試劑溶液，于37 ℃、5% CO2培養箱下繼續培養1 h，用酶標儀測450 nm波長處細胞的OD值。

1.5 細胞克隆形成實驗 檢測膠質瘤細胞系U87和U251的細胞克隆形成。胰蛋白酶消化培養的U87、U251細胞，離心、計數，以2×103個細胞每孔重新接種于12孔板。繼續于37 ℃溫箱中培養2周，每3 d更換一次培養基，PBS洗滌3次后，加入4%多聚甲醛2 mL/孔，固定細胞15 min。去固定液后，加入1%的結晶染色劑1 mL/孔，染色20 min。洗滌染色液后，拍照保存，手動計數克隆。計算克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%。

2 結 果

2.1 慢病毒轉染干擾miR-93在U87和U251細胞中的表達 U87和U251細胞在慢病毒轉染后48 h后，熒光顯微鏡下細胞帶上綠色熒光(圖1)，提示慢病毒已轉染至細胞體內并成功表達。qRT-PCR檢測miR-93在3組(空白對照組、陰性對照組、轉染miR-93抑制物組)細胞中的表達情況。設空白對照組miR-93的表達值為1，U87細胞系轉染miR-93抑制物組表達水平0.022，低于空白對照組和陰性對照組，組間差異有顯著統計學意義(P<0.01)。U251細胞系轉染miR-93抑制物組表達水平0.082；低于空白對照組和陰性對照組，組間差異有顯著統計學意義(P<0.01)。U87和U251的空白對照與陰性對照組的組間差異均無統計學意義。

A：空白對照組U87細胞；B：空白對照組U251細胞，在熒光顯微鏡下無熒光顯色；C：miR-93抑制物組U87細胞；D：miR-93抑制物組U251細胞，在熒光顯微鏡下見熒光顯色(熒光染色，×100)

2.2 miR-93在腦膠質瘤組織中的表達水平變化 與正常腦組織對比，61例膠質瘤組織標本中，44例(72.1%)miR-93表達水平明顯高于正常腦組織。其中WHO Ⅰ級膠質瘤的陽性表達率為20%(1/5)、Ⅱ級為71.4%(15/21)、Ⅲ級為73.3%(11/15)、Ⅳ級為85%(17/20)。WHO Ⅰ-Ⅳ級膠質瘤組織中miR-93的表達量分別是1.25、5.91、6.71、31.20。WHO Ⅰ和WHO Ⅱ、WHO Ⅰ和WHO Ⅲ、WHO Ⅰ和WHO Ⅳ、WHO Ⅱ和WHO Ⅳ、WHO Ⅲ和WHO Ⅳ組間差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

N—正常對照組；**P<0.01 A：U251細胞；B：U87細胞；**P<0.01；U87、U251—空白對照組，U87-NC、U251-NC—陰性對照組，U87-inhibitor、U251-inhibitor—轉染miR-93抑制物組

2.3 miR-93對膠質瘤細胞增殖活性的影響 轉染miR-93抑制物組U87和U251細胞在轉染后24 h、48 h、72 h、96 h的增殖活性比陰性對照及空白對照明顯降低(P<0.05)；陰性對照組與空白對照組U87、U251細胞光密度值之間的差異無統計學意義(圖3)。結果表明抑制miR-93的表達后，膠質瘤U87、U251細胞的體外增殖活性隨之降低。

2.4 miR-93 表達下調對U87、U251細胞克隆形成的影響 轉染miR-93抑制物組的U87和U251細胞克隆形成數比陰性對照、空白對照明顯下降，差異具有統計學意義(均P<0.01)；陰性對照組與空白對照組之間的差異無統計學意義(圖4)。表明抑制miR-93的表達后，可以降低U87、U251的細胞克隆形成能力。

A：平板克隆形成實驗；B：各組細胞克隆數比較；**P<0.01；U87、U251—空白對照組，U87-NC、U251-NC—陰性對照組；U87-inhibitor、U251-inhibitor—轉染miR-93抑制物組

3 討 論

microRNAs作為內源性、非編碼小RNA，通過與mRNA的3′-非翻譯區(3′-UTR)靶向結合，導致靶基因片段降解或失活，與siRNA類似，對靶基因的表達具有負性調控作用[6]。近年來的研究證實，miRNA與許多重要的生物過程相關，包括發育調節，器官形成、細胞增殖和凋亡等。并參與了腫瘤致病過程中的眾多環節，在腫瘤的發生發展中起到重要的作用，有望成為腫瘤治療的新靶點[4,7-8]。之前的研究表明，許多miRNA在膠質瘤中表達異常，一些miRNA在腫瘤耐藥、疾病診斷及預后判斷中顯示出重要的指導作用[9-10]。因此，探明膠質瘤中新的差異表達的miRNA分子，并明確其功能，將其作為治療靶點或生物標記，可為提高膠質瘤患者的診治提供新思路。

前期研究利用miRNA芯片技術，發現miR-93分子在腦膠質瘤中表達異常，與瘤周組織相比，miR-93在腦膠質瘤中過表達[5]。越來越多的研究發現，在許多其他的腫瘤中miR-93表達異常，并在腫瘤發生發展過程中發揮重要的作用。如在非小細胞肺癌中，異常表達的miR-93通過調節PI3K/AKT信號通路，最終促進腫瘤的發生及轉移[11]。在肝癌中，miR-93通過直接作用于PDCD4促進細胞的侵襲和轉移[12]。但在腦膠質瘤中miR-93的表達尚存在爭議，miR-93的功能及其機制還需進一步探討。

其他學者研究表明，miR-93在膠質瘤組織和細胞中過表達，且miR-93的表達水平與腫瘤的惡性程度及患者總生存期密切相關[13-14]。Malekpour等研究報道，應用實時定量PCR檢測178 例腦膠質瘤組織及瘤周組織的miR-93表達水平，與瘤周組織對比，腦膠質瘤組織中miR-93呈現明顯低表達，和之前的研究相反，并且miR-93的低表達與腫瘤的惡性生物學行為及患者的預后相關[15]。本研究通過檢測腦膠質瘤組織和正常腦組織的miR-93表達水平發現，miR-93在膠質瘤組織中普遍高表達。且和腫瘤的WHO分級(腫瘤的惡性程度)呈現一定的相關性。隨著膠質瘤的惡性程度增加，miR-93的表達隨之增加，可為臨床判斷腫瘤的惡性程度提供一定的參考。并且miR-93在一定程度長反映了膠質瘤的惡性程度，可能與其促進膠質瘤細胞的增殖活性相關。本研究發現構建慢病毒載體，抑制miR-93的表達后，膠質瘤細胞U87和U251的增殖活力被明顯抑制；表明miR-93與膠質瘤細胞的增殖能力密切相關。目前miR-93參與腦膠質瘤發生發展的確切機制尚不清楚。有研究顯示，miR-93的上調可通過激活PI3K/AKT 通路，影響腫瘤細胞增殖、遷移、細胞周期等生物學過程，包括PTEN、VEGF、IL-8、PHLPP2、FOXO3等PI3K/AKT 信號通路上關鍵的基因均已被證實受miR-93的直接調控[13,16-17]。此外miR-93還可通過自我調節環路發揮作用，如在腎癌細胞中，STAT3活化后入核結合到 miR-93 上游啟動區域發揮轉錄作用，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。而這過程是通過miR-93特異性結合 DAPK1-m RNA 3’UTR 區，抑制蛋白翻譯所發揮作用的；過表達DAPK1后，又可以反過來影響 STAT3活化，從而影響miR-93的表達[18]。

miR-93系miR-106b-25 cluster的3個成員之一[19]。microRNA組織芯片結果顯示腦膠質瘤組織中miR-106b-25 cluster的成員(miR-106b、miR-93和miR-25)均高表達。miR-92a-3p、miR-18a-5p和miR-19b-3p(miR-17-92 cluster的成員)在WHO Ⅱ級膠質瘤中異常表達，miR-106b-5p、miR-93-5p(miR-106b-25 cluster 的成員)在WHO Ⅲ級膠質瘤中表達異常。miR-106b-25 cluster 和miR-17-92 cluster的成員中4個miRNA分子的種子區(seedregion)完全相同。從第2個到第8個核苷酸被稱為種子區，是miRNA上進化最為保守的片段。相同種子區的miRNA可能識別并結合相同的3’UTR區域，所調控的靶基因可能相同。miR-93表達水平的增高程度可在一定程度上反映腦膠質瘤的惡性程度。而miR-93在WHO Ⅱ級和Ⅲ級膠質瘤中，具有相同種子區的miRNA依次出現，表明與miR-93類似功能的miRNA分子數目增加，這也可能是miR-93過表達與腦膠質瘤惡性程度相關的機制。基于以上，推測miR-106b-25 cluster 和miR-17-92 cluster的成員增加膠質瘤細胞增殖，抑制凋亡，提高腫瘤的惡性程度，參與了膠質瘤的發生發展過程[19-22]。

綜上所述，miR-93在腦膠質瘤組織中高表達，隨著膠質瘤的惡性程度不斷增加，miR-93的表達水平隨之增高；miR-93作為致癌基因，當被抑制后，膠質瘤細胞的增殖活性下降。但miR-93影響腦膠質瘤細胞增殖活性的具體的信號通路及機制尚不清楚，還有待進一步研究探討。