線粒體分裂蛋白DRP1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

范文君，田玉玉，蔡青，馮達(dá)云，折瀟

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)腫瘤，約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的48%[1]。膠質(zhì)瘤因生長(zhǎng)迅速、侵襲性強(qiáng)而預(yù)后不良，患者2年生存率不到15%，5年生存率低于10%[2]。由于膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制不清，傳統(tǒng)的手術(shù)治療加放化療的效果欠佳，90%以上的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在指南推薦的標(biāo)準(zhǔn)放化療后數(shù)月出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3]。

線粒體是細(xì)胞質(zhì)的一個(gè)重要組成部分，近年來許多研究表明線粒體是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素：惡性腫瘤三磷酸腺苷(adenosine Triphosphate,ATP)的產(chǎn)生方式主要為有氧糖酵解；此外線粒體凋亡通路存在異常，提示線粒體功能失調(diào)參與了腫瘤的病理生理機(jī)制[4]。而惡性膠質(zhì)瘤的線粒體結(jié)構(gòu)異常和功能障礙是一個(gè)被忽視的研究方向。線粒體分裂蛋白DRP1定位于胞漿，以多聚體形式發(fā)揮功能，當(dāng)線粒體受到各種理化因素的刺激后，線粒體外膜分裂適配蛋白分子1(mitochondrial adaptor fission 1,Fis1)召集DRP1并轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體外膜處的潛在分裂位點(diǎn)上，DRP1聚合物圍繞線粒體形成指環(huán)結(jié)構(gòu)，通過水解三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)提供能量，逐漸壓縮線粒體使得線粒體斷裂，發(fā)揮分裂線粒體的功能[5]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道DRP1參與脯氨酸代謝、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等重要功能的調(diào)節(jié)[6-7]。此前亦有文獻(xiàn)報(bào)道在膠質(zhì)瘤中DRP1的表達(dá)水平異常增高[8-9]。為此，本研究對(duì)CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNAseq_325的數(shù)據(jù)和臨床資料進(jìn)行多層次分析，檢測(cè)臨床病例的膠質(zhì)瘤(及不同部位)組織的DRP1表達(dá)水平，并分析DRP1表達(dá)水平與患者生存時(shí)間的關(guān)系；以探討線粒體分裂蛋白DRP1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平及其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 資料數(shù)據(jù)收集 中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃(CGGA)由北京市神經(jīng)外科研究所、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院江濤教授團(tuán)隊(duì)建立。目前該數(shù)據(jù)庫(kù)是我國(guó)最全、最新、最科學(xué)的膠質(zhì)瘤圖譜，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含了患者性別、年齡、放療和化療情況、最長(zhǎng)達(dá)4 537 d的隨訪結(jié)果，以及近2 000例不同組織病理分類、不同WHO分級(jí)、原發(fā)/復(fù)發(fā)中國(guó)人群的腦膠質(zhì)瘤的基因組學(xué)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫(kù)于2020年5月6日數(shù)據(jù)更新。本研究獲取了mRNAseq_325這一組數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含325例不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的mRNA測(cè)序，以及該患者的基因突變信息。此外，還收集了TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE16011)中膠質(zhì)瘤的DRP1轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)。

1.2 膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的收集 收集空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科2019年6月—2020年4月手術(shù)切除的14例膠質(zhì)瘤組織樣本，放入液氮中凍存待測(cè)。14例膠質(zhì)瘤組織樣本均匹配有大致正常的瘤旁組織。所有組織樣本的收集、使用經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 DRP1蛋白含量檢測(cè) 采用蛋白免疫印跡方法。將收集到的組織樣本從液氮中取出，分離約10 mg組織樣本，加入500 μL RIPA裂解液，置于冰上，用勻漿器將組織勻漿。之后冰上再靜置裂解20 min，13 000 g離心15 min，收集上清，BCA蛋白定量后加入5×上樣緩沖液。配置10%的下層和5%的上層聚丙烯酰胺凝膠，蛋白電泳分離蛋白樣品；轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育過夜。DRP1(CST,#8570,1∶1 000)，Actin(Abclone AC004,1∶20 000)。

1.4 DRP1 mRNA含量檢測(cè) 取適量組織樣本，加入1 mL TRIzol(America,Invitrogen)，按照說明書提取總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,Japan)反轉(zhuǎn)錄RNA成為cDNA。再采用qPCR檢測(cè)cDNA的含量。引物序列：DRP1(F:5′-GCTCCAGGACGT-CTTCAACA-3′,R:5′-TCTGCTTCCACCCCATTTTCT-3′,)GAPDH(F:5′-CCACCCATGGCAAATTCCATG-GCA-3′,R:5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′)。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤與正常腦組織的DRP1 mRNA水平比較 CGGA-mRNAseq_325數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)顯示，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤的DRP1 mRNA水平明顯低于Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 000 11，P=0.000 068)；但Ⅱ級(jí)與Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤DRP1 mRNA水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.23)(圖1A)。異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)突變是低級(jí)別膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的重要標(biāo)記物，IDH突變導(dǎo)致膠質(zhì)瘤產(chǎn)生超甲基化表型，是腫瘤細(xì)胞表觀遺傳不穩(wěn)定的主要原因。另有研究顯示，同一級(jí)別膠質(zhì)瘤IDH突變者表現(xiàn)出更長(zhǎng)的生存期。IDH突變型膠質(zhì)瘤的DRP1 mRNA水平高于野生型膠質(zhì)瘤(P=0.000 000 005 4)(圖1B)。染色體1p/19q聯(lián)合性缺失作為少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤的診斷標(biāo)志，與化療的敏感性和預(yù)后生存相關(guān)，表現(xiàn)為同級(jí)別的膠質(zhì)瘤之間，1p/19q聯(lián)合性缺失患者的生存期更長(zhǎng)。染色體1p/19q聯(lián)合性缺失型膠質(zhì)瘤的DRP1 mRNA水平高于非缺失型膠質(zhì)瘤(P=0.000 002 7)(圖1C)。與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織的DRP1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)(圖1D)。GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)組(GSE16011)中，對(duì)照組為8例，膠質(zhì)瘤組患者為276例；與對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤組織的DRP1 mRNA明顯降低(P<0.000 1)(圖1E)；膠質(zhì)瘤Ⅱ級(jí)與Ⅲ級(jí)的DRP1 mRNA的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.72)，膠質(zhì)瘤Ⅱ級(jí)與Ⅳ級(jí)相比DRP1 mRNA降低(P=0.018)，膠質(zhì)瘤Ⅲ級(jí)與Ⅳ級(jí)相比DRP1的 mRNA也降低(P=0.001 2)(圖1F)，這與之前CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果一致。

A：CGGA-mRNAseq_325數(shù)據(jù)庫(kù)，各級(jí)膠質(zhì)瘤的DRP1 mRNA水平；B：IDH突變和野生型膠質(zhì)瘤的DRP1 mRNA水平；C：染色體1p/19q聯(lián)合性缺失(Codel)和非聯(lián)合性缺失(Non-codel)膠質(zhì)瘤的DRP1 mRNA水平；D：TCGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫(kù)中的DRP1 mRNA水平；E：GEO數(shù)據(jù)庫(kù)膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)組(GSE16011)，膠質(zhì)瘤組與正常對(duì)照組的DRP1 mRNA水平比較；F：GEO數(shù)據(jù)庫(kù)膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)組(GSE16011)，不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組與正常對(duì)照組間的DRP1 mRNA水平比較

2.2 本組膠質(zhì)瘤與瘤旁組織DRP1蛋白和mRNA水平比較 本研究收集14例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤患者的瘤體組織，同時(shí)獲得少量瘤旁組織，檢測(cè)結(jié)果顯示，6例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤患者膠質(zhì)瘤組織的DRP1蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯低于瘤旁組織(均P<0.05)(圖2)。與前面數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)一致。

A：膠質(zhì)瘤和瘤旁組織的DRP1蛋白檢測(cè)；B：膠質(zhì)瘤與瘤旁組織的DRP1蛋白水平；C：膠質(zhì)瘤與瘤旁組織的DRP1 mRNA水平(T-膠質(zhì)瘤組織，N-瘤旁組織)

2.3 膠質(zhì)瘤不同區(qū)域的DRP1蛋白和mRNA水平比較 本研究對(duì)3例Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤的外緣(交界區(qū))、中心區(qū)和瘤旁區(qū)組織進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與瘤旁區(qū)相比，交界區(qū)與瘤中心區(qū)組織的DRP1蛋白和mRNA表達(dá)水平降低(均P<0.05)(圖3A-I)。不同區(qū)域DRP1蛋白表達(dá)水平的整體統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與瘤旁區(qū)相比，瘤體區(qū)組織的DRP1蛋白表達(dá)水平明顯降低(圖3J)。

A、D、G：膠質(zhì)瘤瘤旁區(qū)、交界區(qū)和中心區(qū)組織的DRP1蛋白水平檢測(cè)；B、E、H；瘤旁區(qū)、交界區(qū)和瘤體區(qū)組織的DRP1蛋白水平；C、F、I：瘤旁區(qū)、交界區(qū)和瘤體區(qū)的DRP1 mRNA水平；J：不同區(qū)域組織的DRP1水平整體統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4 DRP1高表達(dá)與低表達(dá)膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間比較 從CGGA數(shù)據(jù)中分析DRP1的轉(zhuǎn)錄水平與患者生存時(shí)間的關(guān)系顯示，DRP1高表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于低表達(dá)患者(P<0.000 1)；DRP1高表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間比DRP1低表達(dá)組患者長(zhǎng)7年以上。見圖4。

CGGA-mRNAseq_325數(shù)據(jù)庫(kù)中DRP1高表達(dá)和低表達(dá)膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)惡性腫瘤，即使采取積極治療如手術(shù)加標(biāo)準(zhǔn)化療和放療后，復(fù)發(fā)率依然很高，5年生存率很低[1]。近年來基于大規(guī)模高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，以及對(duì)于臨床病例隨訪數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，使得膠質(zhì)瘤的組學(xué)研究和精準(zhǔn)醫(yī)療取得空前的發(fā)展，各種新型輔助治療不斷被報(bào)道，給臨床診療提供了更多的選擇。

CGGA是由首都醫(yī)科大學(xué)北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科江濤教授團(tuán)隊(duì)領(lǐng)銜建立的中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。該庫(kù)中所有樣本均來源于中國(guó)膠質(zhì)瘤患者，涉及近2 000例膠質(zhì)瘤樣本的病理分類、WHO分級(jí)、mRNA芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)、mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)、miRNA芯片數(shù)據(jù)和DNA甲基化芯片數(shù)據(jù)，可進(jìn)行基因突變圖譜、基因表達(dá)分布、DNA甲基化水平的可視化和基因與生存相關(guān)性分析等。以往研究對(duì)小樣本膠質(zhì)瘤的免疫印跡和PCR檢測(cè)，由于樣本量太小及取樣的限制，得出的結(jié)果可能存在一定的偏倚及誤差，而通過分析CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中大樣本測(cè)序再加上一定量樣本的免疫印跡和PCR檢測(cè)結(jié)果，能更準(zhǔn)確地反映膠質(zhì)瘤的特性及特點(diǎn)。這有助于提高對(duì)膠質(zhì)瘤的認(rèn)識(shí)及開發(fā)針對(duì)膠質(zhì)瘤的新干預(yù)策略[10-11]。此外，本研究還觀察了TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)，綜合目前世界上的三大腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，對(duì)膠質(zhì)瘤的DRP1轉(zhuǎn)錄水平及其意義進(jìn)行分析。

線粒體與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。線粒體是細(xì)胞生物能量代謝、生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要樞紐，能幫助細(xì)胞感應(yīng)應(yīng)激及適應(yīng)環(huán)境，因此在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著特殊作用[4]。在不同腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了線粒體動(dòng)力學(xué)的紊亂，表現(xiàn)為與瘤旁組織相比，腫瘤細(xì)胞的線粒體融合/分裂蛋白發(fā)生異常，線粒體形態(tài)也發(fā)生改變。在肝癌、乳腺癌和肺癌中發(fā)現(xiàn)線粒體分裂蛋白DRP1表達(dá)水平升高[12]，而線粒體融合相關(guān)蛋白(mitofusins,MFNs)表達(dá)水平降低[13-14]，即線粒體分裂態(tài)增加，提示腫瘤中線粒體動(dòng)力學(xué)發(fā)生了改變，而通過干預(yù)紊亂的線粒體融合/分裂狀態(tài)可能是潛在的治療靶點(diǎn)[8,15]。然而，腫瘤中線粒體形態(tài)改變并不是一成不變的。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出與大多數(shù)腫瘤不同的線粒體形態(tài)，即DRP1表達(dá)水平降低，分裂態(tài)降低，而線粒體融合狀態(tài)增加；這提示膠質(zhì)瘤中線粒體動(dòng)力學(xué)發(fā)揮著不同于其他腫瘤的作用及效應(yīng)。

線粒體動(dòng)力蛋白DRP1可能參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。線粒體形態(tài)參與細(xì)胞能量代謝的調(diào)控，可間接地影響免疫細(xì)胞的活化和應(yīng)答。近期一項(xiàng)研究表明DRP1功能降低抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，提示線粒體動(dòng)力學(xué)對(duì)于機(jī)體免疫至關(guān)重要[16]。另一項(xiàng)研究[17]發(fā)現(xiàn)，特異性敲除巨噬細(xì)胞中線粒體融合基因Miga2會(huì)導(dǎo)致線粒體過度分裂，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體碎片化，巨噬細(xì)胞會(huì)特異性表達(dá)白介素12(interleukin 12,IL-12)，這會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ(interferon gamma,IFN-γ)，并顯著增強(qiáng)其抗腫瘤免疫的能力；另外，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的T細(xì)胞擁有更多的碎片化線粒體，而當(dāng)腫瘤被清除時(shí)，這些T細(xì)胞會(huì)消亡。然而，在膠質(zhì)瘤中DRP1轉(zhuǎn)錄和翻譯的絕對(duì)降低，使得線粒體分裂態(tài)大幅減少，故而可能使免疫細(xì)胞的激活受到抑制，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)大大降低，這很可能是膠質(zhì)瘤在發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮免疫逃逸的重要原因。

線粒體動(dòng)力蛋白DRP1參與細(xì)胞凋亡的核心調(diào)控。在凋亡早期，胞漿中的DRP1會(huì)轉(zhuǎn)移至線粒體表面，使線粒體發(fā)生嚴(yán)重的碎片化[18-19]。促凋亡蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X,Bax)亦從胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體，并可與DRP1共定位，使線粒體內(nèi)外膜物質(zhì)如細(xì)胞色素C釋放，而細(xì)胞色素C的釋放會(huì)與胞質(zhì)中的凋亡肽酶激活因子1(Apoptotic peptidase activating factor 1,APAF-1)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前體9(procaspase-9)共同組成凋亡體，激活Caspase-9并與Caspase-8一起誘發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)生細(xì)胞凋亡[20-21]。在這一過程中，DRP1的線粒體轉(zhuǎn)位發(fā)揮了重要作用，若通過敲低DRP1阻止DRP1的線粒體轉(zhuǎn)位，線粒體碎片化及細(xì)胞凋亡將會(huì)被抑制，細(xì)胞存活受到保護(hù)[22]。因此，膠質(zhì)瘤的DPR1低表達(dá)很可能限制了多種理化治療對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用，抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡使得治療效果不佳。

綜上所述，本研究通過對(duì)CGGA、TCGA和GEO膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行深入分析，以及臨床膠質(zhì)瘤組織樣本的免疫印跡和PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)瘤中線粒體動(dòng)力學(xué)蛋白DRP1表達(dá)水平異常。與文獻(xiàn)報(bào)道的肝癌、乳腺癌及肺癌中DRP1表達(dá)水平升高不同，膠質(zhì)瘤的DRP1蛋白表達(dá)水平明顯降低。并且DRP1低表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯減少，這可能與DRP1調(diào)節(jié)腫瘤免疫和細(xì)胞凋亡的功能有關(guān)。DRP1表達(dá)水平低可作為反映膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)，對(duì)DRP1低表達(dá)進(jìn)行干預(yù)可能是膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn)。