miRNA205 在神經膠質瘤細胞放療敏感性中的作用

尹 江，張志杰，賀智敏

（廣州醫科大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所，廣東 廣州 510095）

微小RNA（miRNA 或者miR）是指一類由18～25 個核苷酸組成小分子非編碼RNA[1]。miRNA 通過與目的基因信使RNA（mRNA）3’UTR 完全或不完全配對，導致靶基因mRNA 降解或抑制靶基因mRNA 的翻譯，最終抑制靶基因的蛋白表達[2]。人類編碼基因有超過60%的基因受到miRNA 的調控。在腫瘤細胞中，miRNA 常呈現出表達異常的現象[3]。在結腸癌患者組織中，miR506 在癌組織中的表達水平較癌旁組織中的表達水平要高[4]。HBV 病毒蛋白可以抑制miR148a 的表達，可以導致肝細胞癌的發生。神經膠質瘤是成年人中最常見的原發性神經系統惡性腫瘤，其發病率隨著年齡增長而增加。全球每年約30 萬人被診斷患有神經膠質瘤。膠質瘤的臨床治療以手術治療為主，在安全范圍內進行最大程度的切除腫瘤組織，輔以放療和化療。放射治療在膠質瘤的治療中發揮重要作用，能夠明顯延長膠質瘤患者的生存期。越來越多的研究表明miRNA 在膠質瘤的發生發展中發揮重要作用[5]。而miRNA205在膠質瘤中的作用鮮有報道，且其是否參與膠質瘤的放療抵抗有待揭曉，本研究試圖闡述miRNA205與膠質瘤放療敏感性的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 膠質瘤細胞系U251 購自美國樣本典藏中心（ATCC）由本實驗室保存；miRNA205 過表達及對照模擬物（miRNAmimic）、miRNA 逆轉錄試劑盒及定量檢測試劑盒購自廣州復能基因有限公司；rH2AX、-actin 抗體購自CST 公司（Cell Signalling Technology）。

1.2 細胞培養及轉染 膠質瘤細胞系U251 的培養采用含有10%胎牛血清的DMEM 完全培養基，培養條件為37 ℃，5%CO2濃度，飽和濕度。質粒的轉染：將細胞種植在在6 孔板中，每個孔種植105個細胞，待細胞長至70%匯合度時將培養基更換為無血清的DMEM 培養基，采用脂質體試劑Lipofectamine2000，按照操作說明進行轉染實驗，轉染miRNA205 mimics 的細胞作為U251/miRNA205；轉染對照物miRNA control 的細胞為U251/NC。6 h 后再更換為含有血清的完全培養基進行培養，48 h 后進行后續實驗。

1.3 實時熒光定量PCR 檢測 實時熒光定量PCR 檢測又稱RT-qPCR，將U251/NC 及U251/miR205 細胞采用Trizol 法提取細胞總RNA，將2 μg 的總RNA 采用復能生物的All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 2.0 試劑盒逆轉錄miRNA,采用All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit 試劑盒，以U6 為內參，進行miRNA205 表達水平的檢測。

1.4 細胞克隆形成能力檢測 將實驗組細胞U251/miRNA205 和對照組細胞U251/NC 分別種植6 個復孔，待細胞貼壁后未經放射治療組為0Gy 組，或采用X 射線進行放射治療的6Gy 組。轉移至正常條件下進行培養，待細胞克隆生長至約含有50 個細胞的集落，進行結晶紫染色，計數各條件下細胞克隆數量并進行分析。

1.5 免疫印跡實驗（Western Blot）檢測細胞中的蛋白表達 細胞總蛋白的提取采用碧云天公司生產的RIPA 強裂解液。經放療后的U251/miRNA205 和U251/NC 細胞，每隔4 h 收集并裂解，離心收集上清，經BCA 法測定蛋白濃度，煮沸變性后進行Western Blot 分析，每個時間點各樣品的上樣量為30 μg 總蛋白，電泳后轉印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉TBST 溶液進行封閉，抗體以說明書比例采用一抗稀釋液稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，5 min/次，帶辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫條件下孵育2 h，ECL 發光，采用Tanon 化學發光儀進行檢測。

1.6 統計學分析 細胞克隆統計結果采用SPSS 15.0進行統計分析，分析方法是t檢驗，P＜0.05 代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-qPCR 檢測miRNA205 的表達水平 采用RT-qPCR 檢測實驗組U251/miRNA205 及對照組細胞U251/NC 細胞中miRNA205 的表達水平,其中U251/miRNA205 組△CT 值為（12.16±0.31），U251/NC組△CT 值為（15.65±0.39），△△CT 為（3.49±0.19）。經計算U251/miRNA205 中miRNA205 的表達較U251/NC 細胞中miRNA205 的表達上調了（11.3±1.55）倍，且差異有統計學意義（P=0.0003），見圖1。

圖1 RT-qPCR 檢測細胞中miRNA205 的表達水平

2.2 miRNA205 抑制膠質瘤細胞放療后的克隆形成對0Gy 組細胞形成的克隆數量進行計數，U251/NC形成的克隆數為（134.67±7.77），U251/miRNA205 形成的克隆數為（129.67±12.58），0Gy 組的U251/miR205 細胞的克隆數與U251/NC 組無明顯差異，P=0.59；而6Gy 組的細胞進行克隆計數顯示，U251/miR205 細胞形成的克隆數為（15±7.94）個，明顯少于U251/NC 細胞的克隆個數（37.33±5.86），且差異有統計學意義（P=0.0172），見圖2。

圖2 miRNA205 抑制U251 細胞放療后克隆形成能力

2.3 miR205 抑制膠質瘤細胞DNA 損傷修復能力6 Gy的放射劑量均能對細胞產生明顯的DNA 損傷作用，且對U251/miRNA205 及U251/NC 的損傷程度相當。24 h 時U251/NC 組細胞的DNA 損傷水平明顯下降，恢復到放療前水平，而U251/miRNA205 細胞DNA 損傷修復能力變弱，24 h 時DNA 損傷標志物的表達水平仍處于，見圖3。

圖3 Western Blot 檢測rH2A.x 的表達水平

3 討論

miRNA 在細胞的增殖、分化、凋亡等過程均起到一定作用[1]。miRNA 主要通過與靶基因mRNA3’UTR 相互結合，抑制靶基因的翻譯或誘導靶基因mRNA 的降解，從而降低靶基因的表達水平。有研究表明miRNA205 可以通過抑制ZEB1 等基因的表達，抑制乳腺癌細胞干細胞特性的維持[6]。miRNA205 還能通過抑制ErbB 的表達從而導致靶向藥物的治療耐受。miRNA205 被認為可以通過影響腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學行為，參與多種腫瘤的發生發展[7-9]。Chen W 等[10]發現在膠質母細胞瘤中miRNA205 通過抑制ZEB1 發揮作用，抑制膠質母細胞瘤的生長和轉移。在膠質瘤細胞中抑制MiR34a 的表達可以增強其體內成瘤能力，上調miR497 的表達可以強膠質瘤細胞U87 對化療藥物替莫唑胺的敏感性[11]。因此miRNA 可以通過影響多種不同的信號通路發揮癌基因或抑癌基因的作用，本研究的實驗結果顯示，過表達miRNA205 對膠質瘤細胞系U251 的克隆形成能力無明顯影響。

放射治療是膠質瘤等腫瘤重要且有效的治療手段，也是高級別膠質瘤必要的治療方式之一，能夠明顯延長膠質瘤患者的生存期[12]。放射治療的作用機理主要是通過對腫瘤細胞DNA 造成損傷，當腫瘤細胞DNA 發生雙鏈斷裂時，無法修復的腫瘤細胞隨即發生凋亡或增殖停滯，從而實現抑制腫瘤的目的。當DNA 發生雙鏈斷裂時H2A.x 被磷酸化成rH2A.x，因此rH2A.x 的表達水平可以作為DNA 損傷水平的標志物。通過檢測細胞中rH2A.x 的表達水平的變化，可以評價腫瘤細胞對放射治療的敏感性及DNA 損傷修復能力[13]。對放射治療產生抵抗是導致放療失敗的主要原因，然而產生放療抵抗的機制尚不明確，也未有良好的治療方案增強膠質瘤細胞的放療敏感性。本研究的實驗結果顯示，過表達miRNA205 的U251/miR205 細胞經放射治療24 h 后，DNA 損傷標志物未能明顯回復到放射治療前的狀態，而對照組U251/NC 細胞在放射治療24 小時后，DNA 損傷標志物rH2A.X 能夠恢復到正常水平，提示miR205 能夠抑制U251 細胞中DNA 雙鏈斷裂的修復能力。平板克隆形成能力也是反映細胞放療敏感性的一個重要指標，通過對細胞放射治療發現，6 Gy 的放射治療后，對照組U251/NC 能形成（37±6）個克隆而過表達miRNA205 的實驗組U251/miR205 細胞僅能形成（15±8）個細胞克隆，證實過表達miRNA205 能夠明顯抑制U251 細胞放療后的的克隆形成能力，提示miRNA205 具有促進U251 細胞放療敏感性的作用。

綜上所述，miRNA205 能夠抑制U251 細胞的DNA 損傷修復能力，抑制膠質瘤細胞系U251 在放療后的克隆形成能力，最終導致膠質瘤細胞對放療的敏感性增強。提示miRNA205 具有作為膠質瘤放療增敏靶標的價值。