米貝地爾增強3，3′-二吲哚甲烷對肝癌細胞的抑制作用

姜袁越，徐偉，顧杰，葉洋，徐新明，孫俊，陳健，陸榮柱,5

(1. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江212013； 2. 昆山市中醫醫院病理科，江蘇 蘇州 215300； 3.江蘇大學生命科學研究院，江蘇 鎮江212013； 4. 江蘇大學附屬昆山醫院普外科，江蘇 蘇州 215132；5.江蘇大學附屬昆山醫院臨床實驗研究中心，江蘇 蘇州 215300)

調節腫瘤細胞內胞質游離鈣(cytosolic free calcium，[Ca2+]i)可影響腫瘤細胞凋亡、侵襲和轉移等[1]，鈣通道阻滯劑因其阻斷鈣通道運輸[Ca2+]i至周圍細胞的功能，在腫瘤的實驗治療中有所應用[2-4]，可能與降低[Ca2+]i外流，促進[Ca2+]i聚集，進而抑制神經膠質瘤細胞[5-6]、乳腺癌細胞[7-8]、黑色素瘤細胞[9]等腫瘤細胞增殖有關。因此調節鈣離子通道的功能可調控[Ca2+]i水平，進而可以調節腫瘤細胞增殖與凋亡。

研究發現，植物化學物3，3′-二吲哚甲烷(3，3′-diindolylmethane, DIM)能上調IFNγ表達，其主要通過激活與[Ca2+]i相關的p38 MAPK信號通路[10]。我們前期研究發現，[Ca2+]i水平增高和p38 MAPK磷酸化信號轉導激活是鈣離子載體A23187增強DIM抗肝癌細胞效應的重要機制[11]。在前列腺癌細胞中，DIM通過升高[Ca2+]i誘導細胞凋亡，但在宮頸癌細胞中，DIM通過內質網鈣庫的耗竭引起細胞死亡[12]，因而提示DIM擾亂鈣穩態途徑具有腫瘤細胞特異性。因此，本研究擬通過T型鈣通道阻滯劑米貝地爾調控[Ca2+]i，進而探討鈣通道在DIM對肝癌細胞[Ca2+]i的影響中的作用及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

肝癌SMMC-7721和HepG2細胞購自中科院細胞生物學研究所；高糖培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DIM、米貝地爾、[Ca2+]i熒光探針Fluo-3/AM(美國Sigma公司)；CCK-8細胞計數試劑盒(日本Dojindo公司)；β-肌動蛋白、羊抗兔二抗(美國Santa Cruz公司)；兔抗人增殖細胞核抗原(PCNA)、cleaved-caspase 3、p-p38 MAPK單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；ECLIPSE TE2000-U倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 細胞培養

將肝癌SMMC-7721和HepG2細胞培養于含有10%胎牛血清的高糖培養基內，其中含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。將細胞于含5%CO2、37 ℃培養箱內常規培養傳代。

1.3 細胞分組

將肝癌SMMC-7721和HepG2細胞按“1.2”方法培養至細胞融合度達70%～80%時，各分為4組，對照組用含10%胎牛血清的高糖培養基培養24.5 h；米貝地爾組用5 μmol/L米貝地爾處理24.5 h；DIM組用60 μmol/L DIM處理24.5 h；米貝地爾+DIM組用5 μmol/L米貝地爾預處理0.5 h，再與60 μmol/L DIM共同處理24 h，進行后續實驗。

1.4 普通倒置顯微鏡觀察細胞形態

取“1.3”各組處理后細胞，PBS沖洗，倒置顯微鏡觀察細胞形態，并拍照記錄。

1.5 熒光探針檢測肝癌細胞[Ca2+]i水平

以5×105個/孔密度將肝癌SMMC-7721、HepG2細胞接種至6孔板，觀察細胞生長情況；當細胞融合度達70%～80%時，按“1.3”分組處理后，PBS洗滌3次，每次5 min；每孔加入5 μmol/L Fluo-3/AM工作液300 μL，覆蓋細胞表面；37 ℃避光孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min；甘油封片，倒置熒光顯微鏡獲得[Ca2+]i成像，激發波長480～500 nm。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖活力

以5×103個/孔密度將肝癌SMMC-7721和HepG2細胞接種至96孔板。待細胞融合度達70%～80%時，按“1.3”分組處理后，每孔加入CCK-8試劑和高糖培養基的混合物，二者體積比為CCK-8 ∶高糖培養基=1 ∶10，37 ℃避光孵育40 min；測定450 nm波長處光密度(D)值；重復3次。

1.7 Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡水平

以1×104個/孔密度將肝癌SMMC-7721和HepG2細胞接種至24孔板。待細胞貼壁融合度達到70%～80%時，按“1.3”分組處理后，棄培養基，PBS清洗2次；每孔加入300 μL Hoechst染液，37 ℃避光染色30 min；PBS清洗5 min，甘油封片。在紫外光激發的倒置熒光顯微鏡下觀察細胞成像，凋亡指數(%)=凋亡細胞數/(凋亡細胞數+非凋亡細胞數)×100%；重復3次。

1.8 蛋白質印跡法檢測增殖與凋亡相關蛋白表達

取“1.3”分組細胞；棄培養基，將新鮮蛋白裂解液(磷酸酶抑制劑 ∶PMSF ∶RIPA裂解液=2 ∶1 ∶100)加入培養皿置于4 ℃裂解15 min，收集全蛋白； 4 ℃以12 000×g離心15 min，取上清液；BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，加入適量的5×上樣緩沖液，調至相同濃度，經振蕩儀振蕩30 s后，100 ℃煮沸5 min，-80 ℃保存備用。

蛋白于80 V經SDS-PAGE分離；300 mA轉膜90 min至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；將PVDF膜放入對應的一抗稀釋液中，其中PCNA、cleaved-caspase 3、p-p38 MAPK稀釋比均為1 ∶1 000，β-肌動蛋白為內參，稀釋比為1 ∶10 000，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗兔二抗稀釋液(稀釋比為1∶10 000)，室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；在暗室中加入ECL化學發光劑，經凝膠成像系統顯影。采用Lane 1D軟件處理結果圖像；重復3次。

1.9 統計分析

2 結果

2.1肝癌細胞形態學變化

與對照組相比，米貝地爾組細胞形態無明顯變化，但DIM組細胞數變少，細胞分散，分布較稀疏，細胞融合度降低，細胞形態變小、變細，貼壁能力降低。與DIM組相比，米貝地爾+DIM組細胞數量更少，細胞形態破壞更嚴重。由此提示，米貝地爾單獨處理并不能影響細胞形態，卻能夠增強DIM對細胞形態損傷以及降低細胞貼壁能力。見圖1。

圖1 各組肝癌SMMC-7721和HepG2細胞形態學變化(40×)

2.2 米貝地爾預處理增強DIM致肝癌細胞增殖活力下降

CCK-8結果顯示，在肝癌SMMC-7721和HepG2細胞中，與對照組相比，米貝地爾組內細胞活力變化無統計學意義(P>0.05)，但DIM組細胞活力明顯降低(q=11.27, 12.46,P均<0.05)。與DIM組相比，米貝地爾+DIM組SMMC-7721和HepG2細胞活力明顯降低(q=4.973, 5.647,P均<0.05)。由此提示，無細胞毒性的米貝地爾能夠增強DIM導致肝癌細胞增殖活力下降效應。見圖2。

圖2 CCK8法檢測各組肝癌SMMC-7721和HepG2細胞增殖活力變化

2.3 肝癌細胞增殖及凋亡相關蛋白表達變化

在肝癌SMMC-7721和HepG2細胞中，與對照組相比，DIM組PCNA蛋白表達明顯降低(q=12.8, 18.51,P均<0.05)，但米貝地爾組中PCNA蛋白水平變化無統計學意義。與DIM組相比，米貝地爾+DIM組細胞PCNA表達水平明顯降低(q=6.81, 8.35,P均<0.05)。見圖3。由此顯示，米貝地爾本身并不能降低肝癌細胞PCNA蛋白表達，但可增強DIM對肝癌細胞PCNA蛋白表達水平的抑制。

與對照組相比，DIM組細胞cleaved-caspase 3及p-p38 MAPK表達水平均明顯升高(P均<0.05),米貝地爾組cleaved-caspase 3及p-p38 MAPK水平差異無統計學意義(P均>0.05)。與DIM組相比，米貝地爾+DIM組cleaved-caspase 3和p-p38 MAPK蛋白表達水平明顯升高(P均<0.05)。見圖3。由此提示，米貝地爾可增強DIM誘導肝癌細胞cleaved-caspase 3及p-p38 MAPK表達水平升高效應。

圖3 免疫印跡法檢測各組肝癌細胞增殖及凋亡相關蛋白表達水平

2.4 米貝地爾增強DIM誘導肝癌細胞的凋亡效應

與對照組相比，DIM組處理后，肝癌SMMC-7721和HepG2細胞凋亡水平明顯升高(q=6.803，4.811，P均<0.05)，米貝地爾組細胞凋亡水平差異無統計學意義(P>0.05)。與DIM組比較，米貝地爾+DIM組SMMC-7721和HepG2細胞凋亡指數明顯增加(q=11.34, 8.018,P均<0.05)。見圖4。由此提示，米貝地爾雖然對肝癌細胞凋亡水平并無直接作用，但是能夠增強DIM誘導的肝癌細胞凋亡。

圖4 Hoechst染色檢測各組細胞凋亡水平

2.5 肝癌細胞[Ca2+]i熒光水平變化

Fluo 3/AM熒光探針與[Ca2+]i結合后，激發綠色熒光。如圖5所示，與對照組相比，DIM組肝癌SMMC-7721、HepG2細胞內[Ca2+]i水平升高，而米貝地爾組肝癌細胞內[Ca2+]i水平無變化；與DIM組相比，米貝地爾+DIM組[Ca2+]i水平升高。由此提示，DIM能夠升高肝癌細胞內[Ca2+]i水平，米貝地爾預處理能夠增強DIM誘導肝癌細胞內[Ca2+]i水平升高。

圖5 熒光探針法檢測肝癌SMMC-7721和HepG2細胞[Ca2+]i水平(標尺100 μm)

3 討論

本研究發現，T型鈣通道阻滯劑米貝地爾可增強DIM誘導肝癌細胞凋亡、抑制肝癌細胞增殖的效應，其機制與激活p-p38 MAPK信號通路轉導及升高肝癌細胞內[Ca2+]i水平有關。

本研究結果表明，與DIM組相比，米貝地爾+DIM組細胞增殖活力降低且凋亡指數升高，提示聯合使用鈣通道阻滯劑與植物化學物DIM，一方面可抑制肝癌細胞增殖水平，另一方面可提高肝癌細胞凋亡水平，表明T型鈣通道阻滯劑米貝地爾能夠增強DIM(60 μmol/L)的抗肝癌細胞效應，這與鈣通道阻滯劑氨氯地平增強長春新堿對膠質母細胞瘤的化療效果[13]以及米貝地爾提高編碼RAF家族中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的BRAF基因靶向藥物維羅非尼的抗癌效應[14]等研究結果相一致。已有研究發現，多種植物化學物抗癌機制涉及p-p38 MAPK信號通路轉導，如姜黃素誘導肝癌HepG2細胞凋亡，其主要涉及上調cleaved-caspase 3、P53蛋白表達水平及降低總caspase 3蛋白表達水平[15]。細胞內p-p38 MAPK途徑、線粒體途徑、氧化應激途徑是促進細胞凋亡的重要機制[16]。本研究結果顯示，米貝地爾預處理+DIM處理后，cleaved-caspase 和p-p38 MAPK蛋白表達水平明顯升高，提示米貝地爾可激活p38 MAPK蛋白磷酸化信號，進而誘導細胞凋亡，增強DIM抗肝癌效應。

研究表明，擾亂[Ca2+]i可誘導腫瘤細胞死亡，其可能與破壞細胞周期、誘導氧化應激等相關[17]。在成纖維L929細胞中，L型鈣通道抑制劑維拉帕米或硝苯地平可抑制新曲霉素誘導的細胞增殖，其可能與蛋白激酶C功能抑制及cAMP失活相關。鈣通道阻滯劑通過降低cAMP活性，抑制細胞周期，也可通過直接水解caspase-3、caspase-9，誘導p-p38 MAPK活化促進凋亡的發生[18]。本研究結果表明，DIM誘導肝癌細胞內[Ca2+]i熒光水平升高，米貝地爾+DIM組[Ca2+]i熒光強度明顯高于DIM組，由此提示，米貝地爾可增強DIM誘導肝癌細胞[Ca2+]i升高。此外，米貝地爾預處理肝癌細胞凋亡指數與[Ca2+]i均升高，表明凋亡與[Ca2+]i水平升高可能有伴隨效應；細胞cleaved-caspase 3和p-p38 MAPK蛋白表達水平升高可能與米貝地爾增強DIM誘導肝癌細胞[Ca2+]i水平升高相關。[Ca2+]i調控下游鈣調蛋白促進PCNA結構域磷酸化，進而抑制DNA聚合酶合成，阻斷細胞周期[19]。本研究中米貝地爾+DIM組[Ca2+]i升高，而PCNA蛋白表達降低，提示高[Ca2+]i水平可能參與降低PCNA表達水平，[Ca2+]i水平升高可能是米貝地爾增強DIM抑制肝癌細胞增殖的重要機制。

本研究中T型鈣通道阻滯劑米貝地爾對SMMC-7721及HepG2肝癌細胞形態、增殖活力、凋亡水平并無直接作用，其可能與5 μmol/L米貝地爾抑制肝癌細胞膜上鈣通道功能后，肝癌細胞[Ca2+]i外流受限，而胞質內質網、線粒體鈣庫的儲備達到動態平衡有關[20]。

關于米貝地爾與DIM誘導[Ca2+]i的研究仍不完善，需要增加一些新的指標，如胞質游離鈣相關蛋白測定，細胞內質網游離鈣水平檢測等。研究表明，10 μmol/L米貝地爾處理HCT116結腸癌細胞后能夠激活Akt絲裂原活化蛋白激酶通路調控增殖相關通路[21]進而減弱米貝地爾對腸癌的抑制效應，但本研究中無細胞毒性的5 μmol/L米貝地爾并未誘導肝癌細胞增殖和凋亡的變化，這是否與肝癌細胞與結腸癌細胞差異性有關有待進一步研究。