基于網絡藥理學的宣白清肺解毒湯治療新型冠狀病毒肺炎作用機制研究與初證

巨紅葉， 趙國望， 韓立柱， 王曉玲， 崔翔， 宋逍， 唐志書， 宋在鑫

(1. 安康市中醫醫院制劑中心， 陜西 安康 725000； 2. 陜西中醫藥大學藥學院， 陜西 咸陽 712046)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一種急性呼吸道傳染病，具有發病迅速、傳播廣泛、傳染性強的特點，臨床主要表現為發熱、干咳、乏力、呼吸困難、呼吸窘迫綜合征等[1]。根據國家衛健委、國家中醫藥管理局《關于印發新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》，中醫辨證中的疫毒閉肺證所用的處方為麻杏宣白承清肺湯加減[2]。我院專家根據安康地區COVID-19的中醫證候分布特點，在此基礎上增加浙貝母、魚腥草和金銀花，發揮清肺解毒的作用，將其命名為宣白清肺解毒湯。宣白清肺解毒湯綜合了麻杏仁甘石湯、宣白承氣湯、達原飲三方化裁而成，包括麻黃、魚腥草、浙貝母、金銀花、大黃、石膏、桃仁等共13 味藥。全方合用宣肺平喘，清肺解毒，清瀉兼顧，以瀉代清，肺與大腸同治，治氣分防血分；又可化濁辟穢，故可用于寒濕郁肺及疫毒閉肺證。

2020年2月18日納入安康市傳染病院共24例COVID-19患者，其中22例診斷為寒濕郁肺證，2 例疫毒閉肺證，采用柴平湯及我院制備的宣白清肺解毒湯，從發病到癥狀完全消失，其中最短為2 d，最長為18 d，平均7.66 d。截至2020年2月24日，17例患者治愈出院，無一例病情加重[3]。此方相繼在我市疑似COVID-19患者，社區獲得性肺炎中觀察具有一定的療效。

網絡藥理學是基于系統生物學、多向藥理學和計算機生物科學，通過數據庫篩選及分析，用于預測和研究多種藥物活性化合物作用于多靶點、多條通路及相關疾病發生的作用機制[4-5]。本研究旨在網絡藥理學的基礎上，篩選出宣白清肺解毒湯治療COVID-19的活性化學成分，并對相關作用靶點進行聚類分析及代謝通路分析，為研究其可能的藥效作用途徑提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 宣白清肺解毒湯主要活性化合物的篩選

利用TCMSP數據庫(http：∥tcmsp.com/tcmsp.php)對13 味中藥所含活性成分及其性味歸經信息進行檢索，設定參數口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18，分子量(MW)≤500， 氫鍵受體數目(Hacc)<10，氫鍵給體數目 (Hdon)<5，分別構建宣白清肺解毒湯化學成分及其歸經信息數據庫。

1.2 靶標網絡構建和相關疾病靶點的收集

利用TCMSP數據庫查詢13味中藥活性化合物對應的靶標信息，構建靶標信息庫，并通過Uniprot數據庫使其標準化，得到關鍵靶點的基因名。利用GeneCards數據庫(http：∥www.genecards.org/)檢索與COVID-19相關的基因。

1.3 化合物-疾病-靶點網絡及PPI網絡的構建

利用STRING數據庫(https：∥string-db.org/)錄入宣白清肺解毒湯治療COVID-19相關靶點，在“organism”中選擇“homo sapiens”進行檢索，獲得蛋白相互作用關系并進行PPI網絡分析，采用Cytoscape 3.7.2軟件構建化合物-疾病-靶點網絡，并進行模塊化分析。

1.4 宣白清肺解毒湯治療COVID-19靶點富集分析

在DAVID數據庫(https：∥david.ncifcrf.gov/)中對宣白清肺解毒湯治療COVID-19靶點相關通路進行GO和KEGG富集分析，設定閾值P<0.05，使用R軟件對富集結果進行生物功能的可視化分析。

1.5 成分-靶點對接

從宣白清肺解毒湯中選取核心活性化合物山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素與COVID-19相關的血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)進行對接，從RCSB數據庫下載相關蛋白結構，并使用AutoDock軟件進行加氫、加電子、加ROOT等操作。本次研究設定結合能小于-5 kJ/mol為結合顯著性，以此佐證宣白清肺解毒湯作用于COVID-19的合理性。

2 結果

2.1 宣白清肺解毒湯活性化學成分分析

利用TCMSP數據庫對13味中藥所含活性成分進行檢索，按照類藥五原則篩選得到122個活性成分，其中麻黃15個，浙貝母5個，魚腥草5個，苦杏仁17個，瓜蔞10個，大黃6個，金銀花15個，蒼術9個，檳榔5個，草果5個，桃仁22個，葶藶子8個，去掉重復值后共99個。通過在線Venny軟件分析此方交集化合物可知：山柰酚為麻黃、魚腥草、金銀花、葶藶子共有；木犀草素為麻黃、金銀花共有； β-谷甾醇為麻黃、浙貝母、大黃、金銀花、桃仁、葶藶子共有。具體交集化合物參數如表1所示。

表1 宣白清肺解毒湯中交集化合物

2.2 藥物-化合物-靶點網絡

將得到的活性化合物通過TCMSP數據庫預測靶點，共得到638個靶點蛋白，利用Cytoscape軟件構建草藥-化學物成分-靶點網絡。其中黃色代表中藥，紫色代表各藥物獨有的化學成分(每個中藥用其首字母縮寫代表)，藍色代表共有活性化合物(A1～J1)，綠色代表靶點。通過在線分析網絡圖的拓撲性質，以節點的大小表示度值的大小。由圖1可知，網絡圖包括319 個節點，1 094 條邊，其中度值最大的前3位藥材分別是桃仁(16)、金銀花(14)、麻黃(13)。度值最大的前3位藥物活性成分分別為A1、C1、B1；所對應的化合物及度值分別為山柰酚(252)、β-谷甾醇(126)、木犀草素(101)。按度值由大到小排名前3的靶點分別為NCOA2、PTGS2、GABRA1。

圖1 草藥-化合物-靶點網絡圖

2.3 預測宣白清肺解毒湯治療COVID-19靶點

根據Genecards數據庫找到COVID-19相關治療靶點259 個，運用Venny平臺查找宣白湯與COVID-19靶點交集，得到35 個共有靶點，如圖2所示。

圖2 交集靶點韋恩圖

2.4 PPI網絡構建

通過String在線分析35個共有靶點，并設置參數去掉游離靶蛋白，得到PPI核心網絡圖(圖3)， PPI網絡圖共包括34個節點，350條邊。通過Cytoscape 3.7.2軟件對網絡圖進行分析，結果顯示靶蛋白平均節點度值為20.6，最大值為30，最小值為4，高于平均度值的靶點共23個，其中度值>25有13個，這些靶點可能是參與宣白清肺解毒湯治療COVID-19的關鍵靶點。關鍵靶點及度值信息如表2所示。

表2 宣白清肺解毒湯關鍵靶點信息

圖3 宣白清肺解毒湯PPI網絡圖

2.5 靶點通路GO富集分析

從DAVID數據庫中篩選GO富集分析得到GO條目共192個，其中細胞組成條目16個，生物學過程條目157個，分子功能條目19個。通過R軟件對結果進行可視化分析，得到GO富集分析氣泡圖(圖4～圖6)。其中橫坐標表示富集因子，縱坐標表示富集條目，氣泡的大小表示富集個數，氣泡的顏色表示P值大小。生物學過程基因參與最多的條目及個數分別為缺乏配體的外源性凋亡信號通路(14)、藥物反應(14)、脂多糖介導信號通路(13)；細胞組成過程基因參與最多的條目及個數分別為：細胞質(22)、胞質溶膠(20)，細胞核(19)；分子功能過程基因參與最多的條目及個數分別為：蛋白結合(30)、相似蛋白結合(13)、蛋白均聚活性(12)。

圖4 宣白清肺解毒湯核心作用靶點BP氣泡圖

圖5 宣白清肺解毒湯核心作用靶點CC氣泡圖

圖6 宣白清肺解毒湯核心作用靶點MF氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集篩選得到35個富集條目(P<0.01)，如圖7所示。其中與疾病相關的條目為結核病、乙型肝炎、美洲錐蟲病等，以及癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等相關通路條目。對KEGG的35條結果進行聚類分析，可得到8類，其中計數>10的分別為乙型肝炎(14)、美洲錐蟲病(13)、TNF信號通路(10)、甲型流感(10)、阿米巴原蟲病(10)。

圖7 核心活性靶點KEGG代謝通路氣泡圖

2.7 成分-靶點分子對接結果

如圖8所示，3種核心化合物與ACE2結合能均小于-5 kJ/mol ，結構穩定，結合活性較高，說明該類化合物可以直接作用于宿主人體細胞，提高機體免疫力，阻斷病毒侵襲。

A：山柰酚-ACE2：結合能-5.04 kJ/mol；結合位點：ASP543，GLU310，ASN546，SER545；B：β-谷甾醇-ACE2：結合能-6.24 kJ/mol；結合位點：GLU549；C：木犀草素-ACE2：結合能-5.1 kJ/mol；結合位點：SER411；GLN-526

3 討論

中藥復方組分自身的復雜性決定了其通過多成分作用于多個不同靶點而形成多維藥理發揮體系，從而達到治療疾病的目的[6]。本研究利用網絡藥理學的技術和方法，通過數據挖掘共找到宣白清肺解毒湯的活性化學成分122個，靶點1 038個，與COVID-19交集靶點35個，GO富集分析192條，KEGG富集分析得到35個條目，聚類分析得到8類不同通路。

宣白清肺解毒湯性味歸經分析結果顯示，前5個度值最高的中藥活性化合物為山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、常春藤苷元、漢黃芩素。COVID-19危重癥的臨床表現為急性呼吸窘迫綜合征和急性肺損傷，其可能與革蘭氏陰性菌產生的內毒素(脂多糖)及感染導致的膿毒癥有關[7]。研究表明，山柰酚、β-谷甾醇可以減輕脂多糖導致的小鼠急性肺損傷[8-9]；而木犀草素、常春藤苷元和漢黃芩素均具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[10-11]。

在PPI網絡圖中得到與COVID-19交集自由度較高的靶點有BCL2L1、TP53、Bad、CASP8、CASP3。BCL2L1為最經典的抗凋亡基因，同時又能調控自噬，與PPAR-γ、NF-κB、HIF-1 等信號通路有關[12]。TP53為常見促癌基因，其突變主要與腫瘤的惡性進展、復發等存在一定的關聯[13]。Bad是bcl-2家族新發現的一種凋亡促進基因，可與TP53在線粒體上形成Bad/p53復合物，通過誘導Bak的活化和寡聚化從而誘導細胞凋亡[14]。

GO富集結果顯示，在生物學過程富集條目最多的是缺乏配體的外源性凋亡信號通路、藥物反應、脂多糖介導信號通路等。嚴重的獲得性肺炎患者表現出活性氧、 TNF-α和IL-6顯著增加[15]。從KEGG富集分析結果可知，在治療過程中涉及的通路主要有癌癥通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等。研究表明，PI3K/AKT信號通路在肺癌發生發展中起重要作用，通過抑制PI3K/AKT 信號通路蛋白表達和細胞生長，從而誘導細胞凋亡和抑制細胞生長，達到抗腫瘤的效果[16]。TNF信號通路是參與炎癥反應和免疫的主要通路之一，在炎癥反應中起重要作用。由此推測，宣白清肺解毒湯通過抑制炎癥浸潤、誘導細胞凋亡、調節免疫等治療COVID-19。

分子對接結果顯示，山柰酚、β-谷甾醇和木犀草素3種核心化合物與ACE2蛋白活性酶具有穩定的結合活性，能通過直接作用于宿主人體細胞發揮阻斷病毒侵襲的作用，提示宣白清肺解毒湯所含活性化合物具有調控COVID-19相關靶標的生物活性，具有一定的臨床防控新冠病毒的潛力，這與我們的臨床試驗結果相符。

本研究基于網絡藥理學，運用相關數據庫，檢索宣白清肺解毒湯活性化合物及潛在靶點，分析與COVID-19交集靶點，并進一步預測與靶點相關的通路及疾病信息，說明宣白清肺解毒湯是通過多成分協同作用于多靶點及多個通路從而發揮治療COVID-19的作用，后期還需進行相應的實驗加以驗證，確保其結果的準確性、科學性和可靠性。