重樓皂苷A直接靶向活化AMPK誘導結直腸癌細胞自噬

彭鵬，楊書勝，向雨晨，文君，司淵 ，劉瑩,3

(湖北醫藥學院 1. 基礎醫學院； 2. 武當特色中藥研究湖北省重點實驗室；3. 胚胎干細胞湖北省重點實驗室，湖北 十堰 442000)

結直腸癌是全球范圍內的常見惡性腫瘤之一[1]。雖然手術切除、放療、化療一定程度可提高患者總生存率，但晚期結直腸癌患者5年生存率僅14%[2]。

自噬是真核生物體內維持細胞穩態的一種關鍵的降解途徑[3]。自噬在腫瘤的發生發展中發揮著“雙刃劍”的作用。一方面腫瘤細胞可以通過保護性自噬來應對環境或治療所誘導的應激狀態，為自身提供能量“渡過難關”[4]。另一方面，當細胞過度自噬時，會導致細胞的病理變化并引起非保護性自噬/自噬性死亡，起到抑制腫瘤的作用[5]。據報道，一些批準的和/或實驗性藥物在不同類型的腫瘤細胞中誘導非保護性自噬而抗腫瘤[6]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated kinase, AMPK)在維持真核細胞能量穩態中起重要作用[7]，其通過Thr-172磷酸化而發生活化[8]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路是AMPK下游調控自噬的關鍵通路。AMPK能夠通過直接磷酸化而負調控mTOR活性，從而激活自噬發生[9]。研究發現，AMPK可以作為一種腫瘤抑制因子參與多種類型的腫瘤自噬調控[10]。

重樓是一種傳統的中藥材，是百合科植物重樓的干燥根莖[11]。它具有抗真菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種治療用途[12]。重樓皂苷A (Polyphyllin A, PPA, 圖1)是從重樓中提取的一種天然皂苷類成分。研究表明，PPA能夠在肺癌[13]、前列腺癌[14]、膠質瘤[15]等多種腫瘤中誘導自噬進而發揮抗腫瘤作用。但是它在結直腸癌中的作用尚不完全清楚，本研究旨在探討PPA對結直腸癌的抗腫瘤作用及其作用機制。

圖1 重樓皂苷A的化學結構

1 材料和方法

1.1 試劑

RKO和HRT18結直腸癌細胞系購自美國模式培養物集存庫。PPA(純度為98%)購自上海源葉生物科技有限公司。將PPA溶解于二甲基亞砜中并于-20 ℃儲存。二甲基亞砜、MTT(美國Sigma公司)；DMEM高糖培養基(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；兔抗人LC3單克隆抗體、兔抗人AMPK、p-AMPK (Thr-172)、兔抗人p-mTOR(Ser-2448)、mTOR均為美國CST公司產品；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、GAPDH 均為美國Santa Cruz公司產品；一抗稀釋液(日本東洋紡公司)；顯影膠片(日本柯達公司)；pQCXIP-GFP-LC3質粒(美國Addgene公司)；DAPI、Triton X-100、4%多聚甲醛、ECL顯色液均為上海碧云天試劑公司產品；Lipofectamine?3000 (美國Thermo Fisher公司)。

1.2 細胞培養

RKO細胞和HRT18細胞于-80 ℃保存；實驗時，取出細胞，置于37 ℃水浴鍋中快速搖動復蘇；完全融化后轉移至含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM，并置于37 ℃，含5% CO2培養箱中培養。細胞貼壁達80%時，用含EDTA的胰酶消化傳代并繼續培養。

1.3 MTT實驗檢測細胞活力

取“1.2”中處于對數生長期的RKO和HRT18細胞，PBS洗滌，換新鮮DMEM調整細胞密度至6.7×104個/mL，接種于96孔板，每孔加入90 μL細胞懸液，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h。用培養基將PPA稀釋為0、4、8、12、16、20、24 μmol/L，分別取10 μL加入RKO細胞中，每種濃度設4個復孔；另用培養基將PPA稀釋為0、10、20、30、40、50、60 μmol/L，分別取10 μL加入HRT18細胞中，每種濃度設4個復孔；孵育20 h；分別加入10 μL MTT (5 mg/mL)，繼續培養4 h；棄培養基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，避光孵育并充分振蕩均勻；全自動酶標儀檢測490 nm波長處光密度(D)值，并計算細胞活力。細胞活力(%)=(實驗組D值-空白組D值)/(對照孔D值-空白組D值)×100%。篩選合適濃度進行后續實驗。

1.4 細胞分組及處理

取“1.2”中處于對數生長期的RKO細胞和HRT18細胞，以3×105個/孔接種于6孔板，DMEM中培養24 h。根據“1.3”中細胞活力檢測結果，RKO細胞用含不同濃度PPA (0、0.6、0.7、0.8 μmol/L)的DMEM處理24 h，HRT18細胞用含不同濃度PPA (0、1.4、1.6、1.8 μmol/L)的DMEM處理24 h；用于后續蛋白印跡法檢測相關蛋白表達。

1.5 集落形成實驗檢測結腸癌細胞克隆形成能力

取“1.2”中處于對數生長期的RKO和HRT18細胞，以1×103個/孔接種于6孔板中。常規培養2周后，棄培養基，4%甲醛固定10 min，棄除固定液，每孔加入1 mL 0.2%結晶紫染色10 min，洗滌后光鏡下計集落個數。

1.6 免疫印跡法檢測結直腸癌細胞中相關蛋白的表達

收集“1.4”細胞，用含1%PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解20 min；12 000 r/min，4 ℃離心10 min；取上清液，BCA法測定蛋白濃度；加入等體積SDS振蕩均勻，99 ℃裂解5 min；80 V經SDS-PAGE分離蛋白；300 mA恒流轉膜2 h，使蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉1 h；TBST洗膜3次；加入對應的一抗稀釋液(LC3-Ⅱ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR為1 ∶1 000，GAPDH為1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜；TBST緩沖液洗膜5次；加入HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗(2.5%脫脂奶粉稀釋，稀釋比為1 ∶5 000)，室溫孵育2 h；TBST洗膜5次；通過ECL顯色液壓片顯影，得到的圖片用電腦掃描，并用Image J軟件進行灰度分析。

1.7 免疫熒光實驗檢測自噬體形成

取“1.2”中處于對數生長期的RKO和HRT18細胞，以2×105個/孔接種至預鋪載玻片的12孔板，DMEM中培養24 h。按照Lipofectamine?3000操作說明，每孔加500 ng pQCXIP-GFP-LC3質粒，轉染細胞6 h；加入PPA處理RKO細胞(0、0.6、0.7、0.8 μmol/L)和HRT18細胞(0、1.4、1.6、1.8 μmol/L)，孵育24 h；4%多聚甲醛室溫固定20 min；用含0.3% Triton X-100的PBS室溫通透15 min；DAPI染色10 min；通過熒光顯微鏡檢測GFP-LC3自噬體。

1.8 分子對接檢測PPA與AMPK的結合能力

AMPK的三維結構在蛋白質數據庫(Protein Data Bank)中編號為4CFF。α亞基為綠色，β亞基為藍色，γ亞基為洋紅色，配體PPA為紅色。PPA的化學結構如圖1所示。所有的對接實驗運用AutoDock 4.2程序。在AutoDock 4.2計算程序中，采用0.375間隔的70×70×70點陣模塊。使用Lamarckian遺傳算法進行對接計算，算法如下：150的群體，最大值2 500萬次能源評估，最高次數2 000，交叉率0.8，突變率0.02，獨立對接運行50次。使用公差為2的均方根偏差將對接構象聚類，并根據結合自由能評估最終對接結構。

1.9 統計分析

2 結果

2.1 PPA顯著抑制結直腸癌細胞活力

MTT檢測結果顯示，在RKO細胞和HRT18細胞中，與0 μmol/L組相比，PPA各濃度組細胞活力均顯著降低(P均<0.05)；由此說明，PPA抑制細胞活力。PPA在RKO細胞中處理24 h的IC50約為1.38 μmol/L，在HRT18細胞中約為2.89 μmol/L，據此篩選出0.6、0.7、0.8 μmol/L PPA用于RKO細胞后續實驗，篩選出1.4、1.6、1.8 μmol/L PPA用于HRT18細胞后續實驗。見圖2。

a: P<0.05；b: P<0.01，與0 μmol/L PPA組比較

2.2 PPA對結直腸癌細胞克隆形成能力的影響

結果顯示，與0 μmol/L組相比，RKO細胞中0.7、0.8 μmol/L PPA組細胞克隆數明顯減少(t=5.677、10.035，P均<0.05)；與0 μmol/L PPA組相比，HRT18細胞中1.6、1.8 μmol/L PPA 組細胞克隆數明顯減少(t=14.362、17.443，P均<0.01)。由此可見，PPA在一定濃度范圍內能夠顯著抑制RKO和HRT18細胞的克隆形成能力。見圖3。

a:P<0.05；b: P<0.01，與0 μmol/L PPA組比較

2.3 PPA誘導結直腸癌細胞自噬

通過檢測自噬標記物LC3脂化形式(LC3-Ⅱ)的表達變化可以初步確定細胞自噬[16]。免疫印跡結果顯示，與0 μmol/L PPA相比，RKO細胞中0.6、0.7、0.8 μmol/L PPA組中LC3-Ⅱ蛋白表達水平明顯增加(P<0.05或P<0.01)，HRT18細胞中1.4、1.6、1.8 μmol/L PPA組中LC3-Ⅱ蛋白表達明顯增加(P均<0.01)。由此可見，PPA能夠誘導RKO和HRT18細胞中LC3-Ⅱ表達增加(圖4)，表明PPA促進自噬發生。為進一步證明PPA促進結腸癌細胞自噬，將pQCXIP-GFP-LC3質粒瞬時轉染到RKO細胞和HRT18細胞中，結果顯示，與對照組相比，PPA組細胞顯示出綠色熒光斑點化聚集，表明LC3在結腸癌細胞中發生重新分布(圖5)。由此表明，PPA誘導結直腸癌細胞發生自噬。

a:P<0.05；b: P<0.01，與0 μmol/L PPA組比較

圖5 免疫熒光檢測自噬體分布狀態(標尺=15 μm)

2.4 PPA激活結直腸癌細胞中自噬上游AMPK通路

免疫印跡結果顯示，與0 μmol/L PPA相比，RKO細胞中0.6、0.7、0.8 μmol/L PPA組中p-AMPK表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，在0.7、0.8 μmol/L PPA組中，p-mTOR表達水平顯著降低(P均<0.05)；與0 μmol/L PPA組相比，HRT18細胞中1.4、1.6、1.8 μmol/L PPA 組中p-AMPK表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，在1.6、1.8 μmol/L PPA組中p-mTOR表達水平顯著降低(P均<0.05)。由此可見，在一定濃度范圍內，PPA可能通過促進結直腸癌細胞中AMPK活化，進而抑制其下游的重要信號分子mTOR活化。見圖6。

2.5 PPA與AMPK具有結合作用

為進一步明確PPA對AMPK的激活作用，利用AutoDock 4將PPA與AMPK的三維結構進行分子對接。AMPK的α，β亞基中含有變構藥物和代謝物結合位點，此位點主要由α亞基的催化激酶結構域和β亞基的碳水化合物結合調節模塊構成[17]。PPA能夠以-5.65 kcal/mol的鍵能與變構藥物和代謝物結合位點結合(圖7A)并且與結構域的多個氨基酸殘基相互作用，包括：Val-24，Lys-29，Asn- 48，Gln-50，Lys-51，Arg-83，Ser-108，His-109，Asn-111和Ser-138(圖7B)。值得注意的是，PPA上的羥基與Lys-29、Ser-108和Asn-111形成穩定結合的氫鍵，鍵長分別為2.7 ?、2.1 ?、3.0 ?。由此表明，PPA可以直接與AMPK結合。

3 討論

研究發現，多種天然藥物如紫草素[18]、苦參堿[19]等可通過激活自噬而抑制多種腫瘤生長。本研究通過MTT實驗、克隆形成實驗初步證明PPA能夠抑制結直腸癌細胞增殖。LC3-Ⅱ是自噬體形成的關鍵組分[16]。本研究發現，不同濃度PPA均能夠誘導結直腸癌細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達增加；且GFP-LC3自噬體綠色熒光隨PPA濃度增加，由彌散狀態向斑點化聚集，由此表明PPA能夠促進結直腸癌細胞自噬。而PPA對結直腸癌的抑制作用是完全還是部分通過誘導自噬途徑完成，尚待進一步探討。

能量代謝的關鍵調節分子AMPK亦是自噬調控的關鍵激活因子[20]。AMPK可通過直接激活ULK促進自噬活化，亦可通過抑制mTORC1通路而激活自噬[21]。研究發現，臨床常用藥物二甲雙胍[22]、小檗堿[23]等可通過活化AMPK而誘導多種腫瘤細胞自噬性死亡。本研究選用不同濃度PPA處理結直腸癌RKO和HRT18細胞株，除0.6 μmol/L PPA處理的RKO細胞與1.4 μmol/L PPA處理的HRT18細胞中p-mTOR蛋白表達水平較對照組降低無統計學意義外，其他濃度PPA可顯著上調中p-AMPK水平，并抑制mTOR活性，且呈現一定的濃度依賴性。由此推測，PPA可能通過AMPK/mTOR信號而誘導結直腸癌細胞發生自噬。進一步在分子對接模型中發現，AMPK的變構藥物與代謝物的結合位點是PPA的首選結合位點。以往研究表明，幾種AMPK激活劑，如A-769662[24]、水楊酸鹽[25]和Compound-991[26]等可以直接與變構藥物和代謝物的結合位點結合，并在腫瘤治療中表現出較好的效果；它們可通過抑制Thr-172去磷酸化來直接活化AMPKα，也可以通過維持β亞基的構象來間接激活AMPKα。本研究發現，PPA與變構藥物和代謝物的結合位點的多個氨基酸殘基發生相互作用，包括：Val-24，Lys-29，Asn- 48，Gln-50，Lys-51，Arg-83，Ser-108，His-109，Asn-111和Ser-138。最重要的是，PPA上的羥基與Lys-29、Ser-108和Asn-111形成3個鍵長分別為2.7 ?、2.1?、3.0 ?的穩定結合的氫鍵。Ser-108是β亞基自身磷酸化的位點，該位點的磷酸化有利于維持變構藥物和代謝物的結合位點的穩定性和配體結合親和力，從而維持AMPK α亞基Thr-172磷酸化，持續激活AMPK。總之，PPA與變構藥物和代謝物的結合位點可以形成相對穩定的結合關系而直接激活AMPK。

綜上所述，本研究發現天然化合物PPA能夠直接與AMPK的變構藥物和代謝物的結合位點結合而激活AMPK，從而誘導結直腸癌細胞自噬。