膽囊癌患者膽囊癌組織泛素結合酶E2T蛋白表達及其臨床意義探討*

于 濤，李奎武，姚 琳，呂 武

膽囊癌(gallbladder cancer，GBC)是最常見的膽道系統惡性腫瘤之一，全球發病率約為2.5/10萬。該病預后極差，5 a生存率僅為5%[1]。雖然外科根治性手術可提高患者長期生存率，但由于該病發病較為隱匿，惡性程度較高，診斷時符合手術條件的患者占比較低，而失去手術機會的晚期GBC患者僅能接受放化療和靶向藥物等姑息性治療[2，3]。近年來，免疫治療在GBC患者的臨床治療方面受到廣泛的關注。研究發現抑癌因子與腫瘤蛋白表達失衡對腫瘤的發生、發展具有重要的影響。泛素化是指包括泛素分子、泛素活化酶、泛素結合酶等多種分子在內的蛋白質修飾過程，對于維持腫瘤細胞內穩態具有重要的作用[4，5]。泛素酶E2T(ubiquitinase E2T，UBE2T)是泛素-蛋白酶系統的關鍵調節因子，已有研究發現了UBE2T在結直腸癌、鼻咽癌和肝細胞癌表達顯著上調[6-8]，且在不同臨床和病理性參數人群其表達顯著不同，但其在膽囊癌組織的表達及其臨床意義尚不明確。本研究檢測了GBC患者膽囊癌組織UBE2T的表達情況，旨在為GBC的免疫發病機制和分子標記物研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年1月～2017年12月我院肝膽外科收治的膽囊癌患者50例，男26例，女24例；年齡為30～75歲，平均年齡為(60.0±6.8)歲。符合《CSCO膽道系統腫瘤診斷治療專家共識(2019年版)》的相關標準[9]，均經術后組織病理學檢查診斷，入院前未進行過放化療治療。排除標準：①合并嚴重的肝、腎功能不全；②在治療過程中轉院或放棄治療；③圍術期或術后1個月內死亡。分別選擇距離癌邊緣>5 cm的癌旁組織和本院收集的正常膽囊組織50例作為對照。納入對象簽署知情同意書，本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 資料收集 通過電子病歷搜索和收集膽囊癌患者的一般資料，包括性別、年齡、TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和病理學分級。

1.3 膽囊組織UBE2T蛋白表達檢測 采用Western blot法，自液氮中取出膽囊組織和癌組織，使用經過預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)和RIPA細胞裂解液，輕輕吹勻，置于4℃旋轉搖床上充分裂解，提取蛋白。采用BCA法對蛋白質樣品進行定量，調整蛋白濃度后加入4×蛋白上樣緩沖液，水浴鍋煮沸5 min，加入蛋白樣品80μg，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，經過脫脂奶粉室溫封閉后，加入羊抗人UBE2T抗體(Abnova生物科技公司)，在37℃溫箱中孵育1～2 h，以PBST洗滌3次，加入二抗，采用ECL法顯色，在暗室中觀察。應用ImagePro Plus 6.0軟件分析蛋白相對表達量。每組實驗3次，取平均值。

1.4 隨訪 采用門診復查或電話隨訪，患者自手術結束開始接受隨訪，間隔3個月1次，隨訪終點為患者全因死亡，或截止至2020年3月1日。

2 結果

2.1 膽囊癌組織、癌旁組織和正常膽囊組織UBE2T蛋白表達情況 膽囊癌組織UBE2T蛋白表達量為2.9±0.4，顯著高于癌旁組織的(1.5±0.3)或正常膽囊組織的(1.7±0.3，P<0.05，圖1)。

圖1 不同組織UBE2T蛋白相對表達量比較

2.2 不同臨床和病理學特征的膽囊癌患者癌組織UBE2T蛋白表達水平比較 不同性別、年齡UBE2T表達差異無統計學意義(P>0.05，資料未列出)，而不同TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移和病理學分級組織UBE2T表達差異存在統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 不同特征的膽囊癌組織UBE2T蛋白表達比較

2.3 影響膽囊癌患者死亡的危險因素分析 截止到隨訪終點，中位隨訪21.0個月，Logrank分析結果顯示，31例UBE2T高表達(>3.5)和19例低表達(<3.5)膽囊癌患者中位生存時間分別為12.0個月和25.0個月(P<0.05，圖2)；多元Logistic回歸分析結果顯示，TNM分期高、UBE2T高表達、腫瘤浸潤程度高、淋巴結轉移程度高、遠處轉移和病理學分級高是膽囊癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05，表2)。

表2 多元Logistic回歸分析膽囊癌患者死亡的危險因素

3 討論

膽囊癌是一種總體發病率較低但生存情況較差的惡性疾病[10,11]。流行病學調查顯示，國外女性與男性膽囊癌發病比例為2∶1～6∶1，而我國約為1.62∶1。在發病年齡方面，我國膽囊癌主要集中于60～69年齡段。目前，膽囊癌的臨床診斷和治療存在的主要問題在于膽囊癌診斷較晚，處于I/II期人數占比較低，診斷時已處于IV期患者占比超過50%，說明對該病的早期臨床診斷手段較為有限[12]。此外，可用于膽囊癌的免疫治療或靶向治療等精準治療方法較少，僅有較少數的患者接受放療和化療治療，導致患者預后相對較差[13]。因此，迫切需要對膽囊癌發生和發展的機制進行研究，尋找可靠的生物標志物用于患者的早期診斷、靶向治療和預后判斷，對于延長患者生命，提高生存率具有重要的意義。

泛素-蛋白酶系統(ubiquitin-protease system，UPS)和泛素樣蛋白酶系統(ubiquitin-like protease system，UBL)是機體表觀遺傳修飾的關鍵機制，廣泛參與了胚胎發育和DNA修復損傷等生理過程[14，15]。蛋白質泛素化是一種被嚴格調控的可逆性生理過程，主要通過泛素化和去泛素化分子發揮生物學功能，而泛素化和去泛素化分子修飾功能的動態平衡既是維持底物蛋白半衰期穩定的前提，還可維持細胞穩定，對于腫瘤的免疫學過程產生直接的影響。泛素是真核生物特有的小蛋白質，由76個氨基酸殘基組成，在進化上高度保守，幾乎參與了真核細胞所有的信號通路及生物學過程[16，17]。目前，發現的泛素化主要受到泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3組成的泛素化反應體系的調控，其中泛素結合酶E2可催化泛素轉移過程，并進一步受泛素連接酶的下游調控[18，19]。其中UBE2T最早因在范可尼貧血DNA修復損傷過程中的作用被發現，主要定位于染色體1q32.1上，在多種惡性腫瘤中存在明顯的擴增現象。UBE2T可通過將FANCD2和FANCA等因子泛素化的方式，促進DNA損傷的修復，以維持基因組的完整性[20]。體外實驗證明，下調UBE2T蛋白可增強腫瘤細胞對于DNA交聯藥物的敏感性[21]。在結直腸癌、胃癌等惡性腫瘤癌組織，UBE2T表達明顯升高[22，23]。本研究采用Western blot法檢測了膽囊癌患者膽囊組織、癌旁組織和正常膽囊組織UBE2T相對表達水平，結果顯示，膽囊癌患者膽囊組織UBE2T明顯高于癌旁組織或正常膽囊組織，而正常膽囊組織與癌旁組織UBE2T表達無明顯差異。因此，推測UBE2T可能影響了膽囊癌的發生過程。

已有學者報道了UBE2T與多種惡性腫瘤患者預后之間的關系。隨著多發性骨髓瘤患者惡性程度增加UBE2T表達水平也升高，且與患者預后有關[24]。UBE2T高表達與乳腺癌和肺癌患者不良預后顯著相關[25]。本研究結果表明，膽囊癌組織UBE2T蛋白表達與性別或年齡無關，不同TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移喝病理學分級癌組織該蛋白表達不同，提示UBE2T可能參與了膽囊癌的病情發展及轉移過程[26]。因此，UBE2T作為判斷膽囊癌病情及預后的分子標記物存在一定的潛力。本研究采用Kaplan-Meier生存曲線分析了不同UBE2T表達水平膽囊癌患者的預后情況，結果發現UBE2T高表達患者預后顯著差于低表達的患者，提示UBE2T可作為膽囊癌患者的預后標記，以指導臨床治療方案的決策。UBE2T在膽囊癌發生的分子機制尚不明確，但在其他惡性腫瘤，已有研究確定了UBE2T影響腫瘤發生、發展的可能機制。在膀胱癌，沉默UBE2T可導致細胞周期在G2/M期阻滯，誘導細胞凋亡[27]。在骨肉瘤，UBE2T高表達可通過激活P13K/Akt信號通路，促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[28]。在非小細胞肺癌[29]，體外敲低UBE2T可通過抑制wnt/β-catenin通路抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程。

隨著科學研究的不斷推進，蛋白質泛素化作用在惡性腫瘤發生過程中參與蛋白質降解并通過調節免疫系統各類免疫細胞功能而影響先天免疫和適應性免疫過程，其機制被不斷揭示，蛋白質泛素化分子作為腫瘤治療靶點的價值也不斷顯現。本研究結果證明了膽囊癌患者膽囊組織UBE2T蛋白表達顯著升高，可能與病情及不良預后相關。