肝細胞癌癌組織CBX7和PERK表達及其對手術治療后患者預后的影響*

王婷婷，辛 洋，王娜娜

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的一些生物學特征與相關信號通路有關，其中RAF/MEK/ERK信號通路是調節肝癌細胞惡性生物學特征的重要通路之一[1-4]。磷酸化胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，PERK)是調節RAF/MEK/ERK信號通路的下游激酶，是一種關鍵的活性蛋白，最終進入細胞核，激活多種轉錄因子，調節基因的表達[5]。研究表明，PERK在肝癌組織中明顯高表達[6]。除了PERK外，色素框同源蛋白7(chromobox protein homolog 7，CBX7)也是可調控癌細胞的重要蛋白之一[7]。CBX7是在人正常細胞中發現的一種參與調控細胞衰老的轉錄抑制因子，在結腸癌、胃癌和肝癌組織表達下調[8]。同時，CBX7表達也與結腸癌患者預后有著密切的關系。現階段，已確定肝細胞癌癌組織CBX7和PERK表達會出現異常，但有關CBX7和PERK表達對患者治療后預后的影響尚不確定。本研究觀察了肝細胞癌癌組織CBX7和PERK表達及其臨床意義，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2016年1月～2017年1月我院診治的肝細胞癌患者68例，男44例，女24例；年齡34～71歲，平均年齡為(56.33±9.14)歲。符合2015年中國抗癌協會肝癌專業委員會發布的《原發性肝癌規范化病理診斷指南》[9]的標準診斷，腫瘤直徑≤3cm者30例，腫瘤直徑>3 cm者38例；美國癌癥聯合委員會(AJCC)分期：Ⅰ/Ⅱ期，40例，Ⅲ/Ⅳ期28例。排除標準：(1)腫瘤破裂；(2)存在感染；(3)既往或同時伴有其他原發癌灶；(4)近期有輔助放化療或TACE治療者；(5)非肝癌因素導致死亡者。本研究通過醫院醫學倫理委員批準實施。患者給出知情同意書。

1.2 肝癌分期 應用AJCC[10]臨床分期標準，Ⅰ期：孤立的腫瘤無血管浸潤；Ⅱ期：孤立的腫瘤浸潤血管，或多發腫瘤都不大于5 cm；Ⅲ期：多發腫瘤大于 5 cm，單個或多發腫瘤，不論大小，侵及門靜脈的主要屬支或肝靜脈；Ⅳ期：直接侵及除膽囊外的鄰近器官，或穿透腹膜。

1.3 肝組織CBX7和PERK mRNA檢測 所有患者均接受肝癌切除術治療。術后，取癌組織和癌旁肝組織，用剪刀剪碎，加胰蛋白酶消化，提取總 RNA，用BCA 定量試劑盒(貨號：20200103，購自凱基生物)測定 RNA 濃度和純度(Trail購自英國Pepro Tech 公司)，反轉錄合成 cDNA，行PCR擴增，采用2-ΔΔCt法計算RNA相對水平。本實驗以GADPH為內參。GADPH：上游引物：5’-CTCAGACACCATGGGGAGGTGA -3’，下游引物：5’-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’；CBX7：上游引物：5’-CGTCATGGCC TACGAGGA-3’，下游引物為：5’-TGGGTTTCGGACCTCTCTT-3’；PERK:上游引物：5’-GCATCTGCCTGGTTACTTAAG-3’，下游引物：5’-GCATCTGCCTGGTTACTTAAG-3’。

1.4 肝組織CBX7和PERK 蛋白表達檢測 采用免疫組化染色法檢測CBX7和PERK 蛋白表達(抗CBX7抗體，貨號：sc-376274；抗PERK抗體，貨號：sc-377400，均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司)。在每張切片，選擇癌細胞數較多的5個視野，每個視野計數100個細胞，判定蛋白表達陽性率。CBX7表達陽性物為棕黃色，PERK陽性物為棕黃色或深褐色。陰性為淺藍色或白色。參考杜洪巖等[11]報道的評分標準，染色強度得分：無染色或淡黃色為0分；棕黃色為1分；棕褐色或黑色為2分。陽性細胞百分比得分：無陽性細胞記0分，陽性細胞小于25 %記為1分，陽性細胞數在25%～50% 記為2分，陽性細胞數大于50%記為 3 分。總分為染色強度得分×陽性細胞百分比得分。總分≤2分者，劃為低表達組，總分>2分者，劃為高表達組。

1.5 隨訪 在治療后，采用電話或門診復診隨訪，記錄36個月的生存情況。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織CBX7 mRNA和PERK mRNA水平比較 癌組織CBX7 mRNA水平為(0.51±0.10)，顯著低于癌旁組織【(4.11±0.91)，P<0.05】，而癌組織PERK mRNA水平為(4.87±0.99)，顯著高于癌旁組織【(0.58±0.15)，P<0.05，圖1】。

圖1 HCC患者癌組織和癌旁組織CBX7 mRNA和PERK mRNA水平比較

2.2 癌組織CBX7和PERK表達情況 經免疫組化檢測，在本組68例HCC患者癌組織中，CBX7高表達36例(52.9%)，CBX7低表達或陰性32(47.1%)例； 癌組織PERK免疫組化評分>2分者30例(44.1%，高表達)，≤2分者38例(55.9%，低表達，圖2)。

圖2 HCC患者癌組織和癌旁肝組織CBX7和PERK蛋白表達情況 (sABC，400×)1癌組織CBX7蛋白表達陰性；②癌旁組織CBX7蛋白表達陽性；③癌組織PERK蛋白表達陽性；④癌旁組織PERK蛋白表達陰性

2.3 不同臨床和病理學特征患者癌組織CBX7和PERK表達比較 不同腫瘤直徑和AJCC臨床分期患者癌組織CBX7和PERK蛋白表達陽性率存在顯著性差異(P<0.05，表1)。

表1 不同臨床和病理學特征患者癌組織CBX7和PERK表達陽性率(%)比較

2.4 癌組織CBX7和PERK高表達與低表達患者生存率比較 見表2。

表2 癌組織蛋白高表達與低表達患者累積生存率(n，%)比較

3 討論

近年來,隨著對肝癌研究的深入，發現肝癌細胞與眾多蛋白表達和信號通路的表達關系密切,目前研究較多的主要包括:CBX7和PERK等[12，13]。

CBX7是參與調控細胞衰老的轉錄抑制因子，屬于多梳蛋白復合體1中Pc家族的成員。CBX7在不同的癌組織細胞的表達不完全相同[14]。部分學者研究表明在前列腺癌和淋巴瘤組織中CBX7表達增強[15]，而另一部分人則研究發現CBX7在甲狀腺癌、胰腺癌、結腸癌和胃癌組織中表達降低[16]，并將CBX7 定義為一種抑癌基因。本研究檢測了肝癌組織和癌旁組織CBX7基因及其蛋白表達情況，發現癌組織CBX7 mRNA水平顯著低于癌旁組織。有人也發現肝癌細胞CBX7 表達較癌旁組織低[17]。有研究報道CBX7在肝癌組織表達升高[18]，與本研究得出的結論相反，這可能是因為不同肝癌患者體內的肝癌細胞特性不盡相同。不同的肝癌細胞CBX7表達可能存在一定的差異。本研究進一步分析了肝癌組織CBX7表達與術后預后的關系。肝硬化是肝細胞癌發生的原因，也是肝細胞癌患者預后不利的因素[19]。腫瘤數目和腫瘤最大直徑與患者預后關系較為密切。同時，本研究也分析了各組患者的預后情況發現，CBX7低表達組患者預后明顯較差，這可能是因為CBX7低表達組患者肝癌細胞分化和增殖能力較強，更易于轉移和惡性增殖，使得患者生存率降低。

ERK是80年代末期發現的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。ERK蛋白具有調控腫瘤增殖和分化的能力。ERK是RAF/MEK/ERK信號通路的上游分子，其活化后為PERK。研究表明，PERK蛋白的表達與肝癌的進展關系較為密切。ERK活化后形成PERK會影響下游的信號通路，調控腫瘤侵襲和轉移[20]。研究表明，在肝癌組織中PERK表達要高于正常組織。本研究采用了RT-PCR法檢測癌組織和癌旁組織PERK水平情況發現，癌組織PERK mRNA水平顯著高于癌旁組織，免疫組織化學染色法檢測發現，癌組織中大部分被染色為棕黃色，而癌旁組織基本為淡藍色，說明癌組織PERK蛋白表達水平顯著高于癌旁組織。RAF/MEK/ERK信號通路與肝細胞癌的運動能力相關，而PERK是調節RAF/MEK/ERK信號通路的下游激酶。檢測其磷酸化可以有效反映RAF/MEK/ERK信號通路的活化情況。激活的PERK蛋白可調節肝癌細胞的增殖能力和運動能力。本研究發現不同PERK蛋白表達水平患者預后有差異，PERK高表達組預后較差，可能是高表達的PERK蛋白可以激活RAF/MEK/ERK信號通路，使得肝癌細胞的運動能力增強，導致肝癌細胞更易于轉移。