IL-6基因多態性對HBV相關ACLF患者短期預后的影響

魯小龍，解春寶

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈全球性流行，慢加急性乙型肝炎肝衰竭(hepatitis B virus related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)患病率占所有肝衰竭的70%以上。由于病情危重，缺乏有效的治療手段，導致該病短期病死率高達35%～50%[1，2]。HBV-ACLF發病機制復雜，可能與病毒復制、炎癥反應、細胞病變等密切相關，其中肝內炎癥在代償性肝損傷向ACLF進展過程中發揮著重要作用，可引起中性粒細胞釋放大量過氧化物酶、彈性蛋白酶、蛋白酶等直接誘發組織損傷，而彈性蛋白酶亦可破壞細胞外基質和基底膜，引起血管內皮功能損傷，從而加速ACLF病情進展[3]。白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)由淋巴細胞、內皮細胞和成纖維細胞等多種細胞產生，具有多種功能，參與肝臟代謝，可誘導肝臟細胞再生，其血清水平與肝細胞壞死程度密切相關，在很大程度上可反映肝衰竭的嚴重程度，已被證實與ACLF的發生和發展有關[4]。IL-6基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與多種非感染性炎癥和自身免疫性疾病的易感性有關，還與慢性乙型肝炎的發生發展密切相關[5]。本研究旨在探索IL-6基因不同rs1524107、rs2069837、rs2069840和rs2069845位點SNP分型的HBV-ACLF患者短期預后的差異，為臨床診療提供新的思路，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年4月～2020年4月我院收治的HBV-ACLF患者134例，男101例，女33例；年齡18～68歲，平均年齡為(47.8±15.1)歲。符合《肝衰竭診治指南(2012年版)》的診斷標準[6]，在已知HBV感染的基礎上有黃疸和(或)凝血功能障礙，出現失代償性腹水和(或)肝性腦病。排除標準：其他病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性和酒精性肝炎、肝豆狀核變性、藥物性肝損傷、患有嚴重的器質性疾病、惡性腫瘤、已接受肝移植治療、長期接受抗凝藥物治療、精神性疾病、妊娠或哺乳期婦女。所有患者簽署知情同意書，本研究經我院醫學倫理委員會審批。

1.2 外周血IL-6基因多態性檢測 采集外周靜脈血，采用Axygen 血液DNA抽提試劑盒提取DNA，經篩選1000個基因組數據庫，應用Haploview軟件排除強連鎖的基因位點，選擇4個IL-6 SNP位點，即rs1524107、rs2069837、rs2069840和rs2069845。設計引物序列(上海天昊生物科技有限公司)，其中rs1524107正向引物為GCCCCCACTCCACTGGAATTT，反向引物為TCAGCCATCTTTGGAAGGTTCA；rs2069837正向引物為CCTACCACCTCTGGACTCCATCA，反向引物為TGGGTTCAGTTCCAAGCTCACCT；rs2069840正向引物為TCCAGGCAGCAACAAAAAGTGG，反向引物為CTCACCACAGTGGCACCATCTC；rs2069845正向引物為TTGTGGTGTGGAGTCTGACTTAGCA，反向引物為CCCTCTCACCATCCCTTTAGGATCT。采用imLDRTM多重SNP分型試劑盒(成都福際生物技術有限公司)檢測IL-6基因上述4個位點的基因型，應用Gene Mapper 4.1軟件(Applied Biosystems)進行原始數據分析。

1.3 血液和血清檢測 使用日本日立7600-120全自動生化分析儀檢測血生化指標(四川邁克生物股份有限公司)；使用日本SYSMEX XN-9000全自動血液分析儀檢測血常規指標(四川邁克生物股份有限公司)；使用日本SYSMEX CS-5100型全自動血凝儀檢測凝血功能指標(四川邁克生物股份有限公司)；使用美國貝克曼DXI 8000型全自動電化學發光分析儀檢測降鈣素原(PCT，四川科遠醫療儀器有限公司)。

2 結果

2.1 兩組肝功能指標比較 在本組134例ACLF患者中，90 d生存99例(73.9%)，死亡35例。死亡組血清總膽紅素、INR和血肌酐(sCr)顯著高于生存組，而外周血血小板計數顯著低于生存組(P<0.05，表1、表2)。

表1 兩組肝功能指標和PCT水平比較

表2 兩組血肌酐和血常規指標比較

2.2 兩組IL-6基因各位點的基因型頻數分布比較 IL-6基因rs1524107、rs2069837、rs2069840和rs2069845位點分布情況均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性。兩組IL-6基因rs1524107、rs2069837、rs2069840和rs2069845位點的基因型頻數分布比較，差異無統計學意義(P>0.05，表3、表4)。

表3 兩組IL-6基因rs1524107/rs2069837位點基因型頻數分布(%)比較

表4 兩組IL-6基因rs2069840/rs2069845位點基因型頻數分布(%)比較

2.3 兩組IL-6基因各位點等位基因頻數分布比較 兩組IL-6基因rs1524107、rs2069837、rs2069840和rs2069845位點等位基因頻數分布比較，差異無統計學意義(P>0.05，表5、表6)。

表5 兩組IL-6基因rs1524107/rs2069837位點等位基因頻數分布(%)比較

表6 兩組IL-6基因rs2069840/rs2069845位點等位基因頻數分布(%)比較

3 討論

ACLF屬一種嚴重的急性肝臟疾病癥候群，通常指在慢性肝病的基礎上短期內遭受各種有害因素的侵襲，進而出現一系列以肝功能失代償為主要表現的臨床綜合癥，常見的病因包括生物因素(如病毒、細菌、真菌感染等)和化學因素(如酒精、藥物等)。不同地區ACLF存在一定的差異，而我國屬病毒性肝炎流行區，以HBV感染最為常見，故因HBV感染所致ACLF較為常見，占所有肝衰竭的70%以上[7]。HBV-ACLF屬一種特定綜合征，病情兇險，發展迅猛，臨床救治困難，短期病死率高達50%～90%[8]。有人回顧性分析122例HBV-ACLF患者的臨床資料發現3個月病死率為26.2%[9]。本研究隨訪134例HBV-ACLF患者3個月預后情況，發現有35例(26.1%)患者死亡。另有報道顯示，HBV-ACLF患者短期病死率高達35%～50%[10]。

HBV-ACLF的發病機制十分復雜，尚未完全明確，可能與病毒感染直接損傷和相關免疫因素介導損傷有關。HBV感染人體后通過在肝細胞內持續復制，致使淋巴細胞、中性粒細胞等免疫細胞逐步浸潤至肝臟，最終出現免疫損傷和炎癥破壞[11]。免疫介導的損傷機制認為“三重打擊”學說發揮著重要作用，表現在以下方面：(1)“第一重打擊”：即免疫損傷，藥物、病毒等因素間接或直接引起正常肝細胞免疫損傷，觸發局部免疫因素后出現一系列反應，誘導肝細胞死亡；(2)“第二重打擊”：即缺血缺氧，肝組織出現局部缺血缺氧，干擾微循環，致使慢性炎癥反應和炎癥性損傷；(3)“第三重打擊”：即內毒素血癥，多種因素干擾下肝細胞死亡，致使大量內毒素出現，誘發內毒素血癥，促使肝細胞死亡加速。此三重打擊誘導肝衰竭病情急驟惡化[12]。

IL-6屬機體內復雜細胞因子網絡中的核心組成成員，也是白介素家族中多功能的多肽類細胞因子，主要由T淋巴細胞、單核-巨噬細胞、纖維母細胞合成，具有多種生物學活性，參與多種免疫細胞的增殖及分化過程，并調節肝臟急性期反應和造血等過程，屬炎癥及免疫機制過程中較為重要的炎癥介質[13,14]。IL-6在免疫應答、造血系統、炎癥反應及機體生理平衡維持中均起著重要作用。在肝損害發生時，血清IL-6水平較正常機體明顯升高，易引起自身免疫反應，致使自然殺傷細胞的吞噬功能增強，介導肝細胞損傷，與肝細胞壞死程度密切相關[15]。盡管IL-6與肝病的發病密切相關，但以往研究表明，IL-6基因的8個SNP位點，包括rs1524107、rs1800795、rs1800797、rs2069827、rs2069830、rs2069837、rs2069840和rs2069845，與慢性乙型肝炎進展至ACLF并無關系[16]。慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者IL-6基因rs1800796位點多態性并無顯著性差異[17]。IL-6 SNP與ACLF疾病風險也無明顯的相關性[18]。但也有報道顯示，在肝硬化和肝癌患者，IL-6基因SNP某些位點發生了變化[19]。為了探討IL-6 SNP與HBV-ACLF患者短期預后的關系，本研究通過檢測死亡組和生存組患者血清IL-6基因rs1524107、rs2069837、rs2069840和rs2069845共4個位點的SNP分型，結果顯示死亡組和生存組IL-6基因rs1524107、rs2069837、rs2069840和rs2069845位點的基因型和等位基因頻數分布并無明顯差異，說明試圖應用該檢查推測預后可能要失望了。研究顯示HBV相關的慢性肝臟疾病嚴重程度與IL-6 SNP卻并無明顯的關系。多種轉錄因子調控IL-6的轉錄過程。本研究僅選擇最小突變頻率≥0.1的SNP進行分析，而IL-6基因單核苷酸位點有150多個，我們并未探討其他潛在可能位點與HBV-ACLF患者短期預后的關系。針對不同人群，其IL-6基因SNP分型差異明顯，本研究未探討不同人群IL-6基因SNP分型與HBV-ACLF患者短期預后的關系。本研究發現生存與死亡的HBV-ACLF患者IL-6基因rs1524107、rs2069837、rs2069840和rs2069845位點SNP分型無顯著差異，提示應選擇常規預測指標考慮患者的預后問題。本研究只分析了IL-6基因位點多態性，并未系統分析基因表達及其傳導通路相關的細胞因子的作用。因此，今后要進一步證實IL-6 SNP與HBV-ACLF患者短期預后的關系，仍需選擇更多的基因和更為廣泛的SNP位點進行深入研究。