慢性丙型肝炎患者血清microRNA-1273g-3p水平預(yù)測肝硬化價(jià)值分析*

王嘉妮，劉 湧，周 忻，任傳路，繆惠鍇

慢性丙型肝炎(CHC)患者肝細(xì)胞長期受損，約35.8%可能進(jìn)展為肝硬化[1,2]。微小核糖核酸(microribonucleic acid，miRNA)為單鏈、內(nèi)源性、非編碼RNA，由21～25個(gè)核苷酸組成，參與細(xì)胞增殖、分化等多個(gè)生物學(xué)過程，具有十分重要的作用[3，4]。微小核糖核酸-1273g-3p(microribonucleic acid-1273g-3p，microRNA-1273g-3p)水平與患者血清細(xì)胞因子水平及肝功能損傷緊密相關(guān)[5，6]。本研究檢測了CHC患者血清microRNA-1273g-3p水平變化，并探討了其預(yù)測肝硬化發(fā)生的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2018年3月～2020年8月我院收治的CHC患者125例，男74例，女51例；年齡為29～73歲，平均年齡為(54.3±9.1)歲；體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)為19.5～26.8 kg/m2，平均為(23.8±6.5)kg/m2；CHC病程為5～13年，平均為(9.6±2.7)年。符合《慢性丙型肝炎防治指南》《肝硬化診治指南》[7，8]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤、藥物性肝損傷或酒精性肝病、合并其它肝炎病毒感染者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 血清microRNA-1273g-3p水平檢測 采集外周靜脈血5 mL，4℃冷凍離心機(jī)12000 r/m離心10 min，分離血清。采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)法檢測血清microRNA-1273g-3p水平：采用Trizol法提取miRNA，在杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)的Nano-500微量分光光度計(jì)上檢測RNA濃度和純度。采用Taqman miR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)，按說明書要求提取總miRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)Nectin-4和內(nèi)參基因β-actin上下游引物，Nectin-4上游引物：5’-CTCAGTTCAGGATCAATGCAT-3’，下游引物：5’-CAGTTACTACGTACATGACCT-3’，產(chǎn)物長度121 bp；β-actin上游引物：5’-ATCACGTATTGCTACTGAAC-3’，下游引物：5’-TCAGTACATGTACATGACAT-3’，產(chǎn)物長度113 bp；反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Mix 1 μL，10×cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，加H20 8 μL，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次。使用美國ABI公司生產(chǎn)的ABI-7300型熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，20 s；40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-△△Ct計(jì)算microRNA-1273g-3p相對水平。

2 結(jié)果

2.1 CHC患者肝硬化發(fā)生情況 經(jīng)臨床、血生化和影像學(xué)檢查，在本組125例CHC患者中，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者42例(33.6%)。

2.2 CHC患者發(fā)生肝硬化的單因素分析 經(jīng)Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)CHC發(fā)生肝硬化患者BMI、病程、輸血史、血脂異常、未抗病毒治療和血清microRNA-1273g-3p水平與CHC患者比，差異顯著(P<0.05，表1)；經(jīng)Logistic多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)上述因素均是CHC患者發(fā)生肝硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2、表3)。

表1 兩組臨床資料比較

表2 影響CHC患者發(fā)生肝硬化的自變量賦值結(jié)果

表3 CHC患者發(fā)生肝硬化的多因素Logistic回歸分析

2.3 血清microRNA-1273g-3p水平預(yù)測CHC患者發(fā)生肝硬化的價(jià)值 經(jīng)ROC分析顯示，以血清microRNA-1273g-3p水平1.56為最佳截?cái)帱c(diǎn)，其AUC值為0.844(95%CI：0.768～0.902)，預(yù)測CHC患者發(fā)生肝硬化的靈敏度為78.6%(33/42，95%CI：73.1%～83.2%)，特異度為86.8%(72/83，95%CI：82.5%～90.6%)，準(zhǔn)確度為90.4%(113/125，95%CI：73.1%～83.2%，圖1)。

圖1 血清microRNA-1273g-3p水平預(yù)測CHC患者發(fā)生肝硬化的ROC曲線

3 討論

肝穿刺活檢為診斷肝硬化的金標(biāo)準(zhǔn)，其屬于有創(chuàng)檢查，且存在一定的局限性。相關(guān)研究顯示[9-12]，miRNA的異常表達(dá)與肝組織纖維化、炎癥因子抑制等有關(guān)，不同的miRNA在不同組織、細(xì)胞中所發(fā)揮的作用不同，同一miRNA在不同疾病中的表達(dá)也不同。故而，探討microRNA-1273g-3p對CHC患者發(fā)生肝硬化的預(yù)測價(jià)值尤為重要。

miRNA由21～25個(gè)核苷酸組成，其異常表達(dá)與器官纖維化、腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移等有關(guān)[13,14]。miRNA序列在人類基因序列中的占比僅為3%左右，但參與約35%左右基因水平的調(diào)控，在機(jī)體生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化及凋亡等方面均具有十分重要的作用。近年來，隨著眾學(xué)者對miRNA的深入研究發(fā)現(xiàn)，在藥物性肝損傷、酒精性肝炎等多種慢性肝臟疾病中均存在miRNA表達(dá)水平差異[15-17]。相關(guān)研究報(bào)道[18-20]，miRNA在肝臟的形態(tài)維持、功能發(fā)揮方面均起重要作用，其中包括miR-132和miR-125b等。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-1273g-3p可能通過調(diào)控PTEN參與慢性肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展。通過對57例CHC患者外周血microRNA-1273g-3p水平進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)CHC合并肝纖維化患者血清microRNA-1273g-3p水平明顯高于未發(fā)生肝纖維患者，且其水平隨著肝纖維化的進(jìn)展而逐漸升高，可對臨床肝纖維化程度進(jìn)行判斷。本研究中，有42例CHC患者發(fā)生肝硬化，發(fā)生率為33.6%。肝硬化組血清microRNA-1273g-3p水平明顯高于CHC組，提示CHC合并肝硬化患者血清microRNA-1273g-3p表達(dá)水平上調(diào)，呈高表達(dá)，發(fā)揮促使肝硬化發(fā)生的作用，可能參與了肝硬化的發(fā)生和發(fā)展。

本研究通過分析影響CHC患者肝硬化發(fā)生的因素，發(fā)現(xiàn)BMI>24.0kg/m2、病程長、輸血制品感染病毒、血脂異常、未抗病毒治療、血清microRNA-1273g-3p高水平等均與肝硬化的發(fā)生有關(guān)，提示上述指標(biāo)均是影響CHC患者發(fā)生肝硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，需加強(qiáng)防控，逐一控制各項(xiàng)危險(xiǎn)因素的不良影響，以達(dá)到降低肝硬化發(fā)生的目的。相關(guān)研究報(bào)道，肥胖、血脂異常等均為影響CHC患者肝硬化進(jìn)程的危險(xiǎn)因素。抗病毒治療能夠緩解肝臟炎性反應(yīng)，可有效延緩肝硬化的發(fā)生。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相符，近一步證實(shí)CHC患者肝硬化發(fā)生與BMI、血脂異常、是否接受抗病毒治療等多種因素有關(guān)。本研究通過ROC曲線分析顯示血清microRNA-1273g-3p水平預(yù)測CHC患者發(fā)生肝硬化的最佳截?cái)帱c(diǎn)為1.56，其AUC值為0.844，靈敏度為78.6%，特異度為86.8%，準(zhǔn)確度為90.4%，說明microRNA-1273g-3p水平在評(píng)估CHC患者發(fā)生肝硬化方面具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，可作為早期檢測指標(biāo)，對CHC患者進(jìn)行早期的診斷并積極采取有效的治療措施，以降低CHC患者肝硬化的發(fā)生率。