抑制TRAF6基因表達對自身免疫性肝炎大鼠肝組織NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

劉 娜，張華敏，鄧巧娟

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)為自身免疫反應引起的慢性肝炎，可引起肝纖維化的發生，而炎癥因子對AIH患者肝纖維化進程有著至關重要的作用[1]。腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)是TNF超家族和Toll/IL-1受體(Toll/IL-1 receptor，TIR)超家族的重要結合蛋白，可促進促炎性細胞因子基因的轉錄，啟動炎癥級聯反應[2，3]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)復合物主要由p50和p65二聚體組成，激活后轉運到細胞核誘導炎性細胞因子的過度產生和釋放，損傷肝臟[4]。有研究發現，TRAF6可誘導IκB激酶(IKK)復合物磷酸化，從而激活NF-κB并誘導炎癥細胞因子基因的表達[5]。本研究通過建立AIH大鼠模型并干擾肝組織TRAF6表達，以探討抑制TRAF6基因表達對AIH大鼠肝臟炎癥水平和NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 雄性SD大鼠60只，4～6周齡，體質量為180～220 g，購自中國科學院昆明動物研究所【實驗動物許可證號：SYXK(滇)K2017-0009】。Trizol和Lipofectamine 2000轉染試劑盒(美國Invitrogen公司)；TRAF6和β-actin引物(廣州華大基因科技有限公司)；抗TRAF6抗體(美國Abcam公司)；抗IκBα、抗NF-κB p65、抗NF-κB p50、抗p-NF-κB p65和抗p-NF-κB p50抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；檢測ALT和AST試劑盒(中生北控生物技術有限公司)；檢測IL-1β和IL-6 的ELISA試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司)。

1.2 AIH大鼠模型的建立 取大鼠20只，制備肝細胞特異性抗原S-100。隨機選擇10只大鼠作為正常組，正常飼養，在另30只大鼠，根據參考文獻[6]，采用特異性抗原S-100誘導AIH大鼠模型。將造模大鼠隨機分為模型組、空載體組和干擾組(TRAF6 shRNA組)，每組10只。在空載體組和TRAF6 shRNA組，采用脂質體法分別轉染沒有插入外源基因的載體(control-shRNA)和TRAF6 shRNA，而給予模型組生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續7 d。

1.3 肝組織TRAF6 mRNA水平和蛋白表達檢測 采用qRT-PCR檢測TRAF6 mRNA水平，用Trizol提取肝組織總RNA，逆轉錄成cDNA。取cDNA 1 μl，行qRT-PCR。采用2-△△Ct法計算TRAF6基因相對水平。TRAF6正向引物：5′-AAGATTGGCAACTTTGGGATG-3′，反向引物5′-GTGGGATTGTGGGTCGCTG-3′；β-actin正向引物：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，反向引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。取大鼠肝組織，常規切片，4 μm。將切片脫蠟、水化、抗原修復；加兔抗TRAF6單克隆抗體孵育1 h，PBS沖洗，滴加山羊抗兔二抗孵育10 min。滴加DAB顯色劑，行蘇木素復染。依次經過無水乙醇各5 min，二甲苯20 min，用中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察。

1.4 肝組織IL-1β和IL-6水平檢測 取肝組織制成勻漿，離心取上清，采用ELISA法檢測。

1.5 肝組織NF-κB通路相關蛋白表達檢測 提取肝組織總蛋白，以BCA法行蛋白定量。采用Western blot法檢測，經瓊脂糖凝膠電泳、轉膜、封閉，加一抗(1:1000)，4℃過夜，加二抗(1:2500)，室溫孵育1 h。顯影，應用Image J分析軟件計算蛋白表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織TRAF6蛋白表達情況 TRAF6陽性表達定位于細胞質，呈棕黃色染色顆粒。與正常組比，模型組大鼠肝組織TRAF6蛋白表達顯著增強(P<0.05)；與模型組比，TRAF6 shRNA干預組大鼠肝組織TRAF6蛋白表達顯著減弱(P<0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織TRAF6蛋白表達比較(SP，200×)A:正常組；B：模型組；C：空載體組；D：TRAF6 shRNA干預組

2.2 各組大鼠肝組織TRAF6 mRNA水平比較 與正常組比，模型組大鼠肝組織TRAF6 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比，TRAF6 shRNA干預組大鼠肝組織TRAF6 mRNA水平顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠肝組織TRAF6 mRNA水平比較

2.3 各組大鼠肝組織IL-1β和IL-6水平比較 與正常組比，模型組大鼠肝組織IL-1β和IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比，TRAF6 shRNA干預組大鼠肝組織IL-1β和IL-6水平顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠肝組織勻漿細胞因子水平比較

2.4 各組大鼠血清ALT和AST水平比較 與正常組比，模型組大鼠血清ALT和AST水平顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；抑制TRAF6基因表達后，大鼠血清ALT和AST水平顯著降低(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠血清ALT和AST水平比較

2.5 各組大鼠肝組織病理學變化情況 在光鏡下，正常組大鼠肝組織結構正常，肝細胞結構清晰，未見明顯的炎癥細胞浸潤；模型組和空載體組大鼠肝組織結構排列不規則，肝細胞體積增大，可見少許空泡樣變性，部分肝組織可見局灶性壞死，存在明顯的炎性細胞浸潤；TRAF6 shRNA干預組大鼠肝細胞水腫減輕，炎性細胞浸潤明顯減少(圖2)。

圖2 各組大鼠肝組織病理學表現(HE，200×)A:正常組；B：模型組；C：空載體組；D：TRAF6 shRNA干預組

2.6 各組大鼠肝組織NF-κB信號通路相關基因蛋白表達比較 與正常組比，模型組和空載體組大鼠肝組織NF-κB信號通路相關蛋白表達均顯著增強(P<0.05)；與模型組比，抑制了TRAF6基因表達后大鼠肝組織NF-κB信號通路相關蛋白表達顯著減弱(P<0.05，圖3、表4)。

圖3 各組大鼠肝組織NF-κB信號通路相關基因蛋白表達比較A:正常組；B：模型組；C：空載體組；D：TRAF6 shRNA干預組

表4 各組大鼠肝組織NF-κB信號通路相關基因蛋白表達水平比較

3 討論

AIH系較難控制的慢性肝炎[7]。促炎細胞因子IL-1家族成員和IL-6在進一步激活自身免疫反應效應細胞、促進免疫反應和自身免疫性疾病的形成等方面發揮重要作用。AIH是一種主要由T細胞介導的疾病，IL-1和IL-6被認為是肝細胞被破壞的兩個主要因素，它們的血清水平與轉氨酶水平、細胞死亡標志物和疾病嚴重程度標志物直接相關[8-10]。另有研究報道，在肝臟受到損傷時，血清ALT和AST水平升高在一定程度上能夠反映肝細胞的損傷程度[11]。本研究結果發現，與正常組比，模型組大鼠肝組織勻漿IL-1β和IL-6水平、血清ALT和AST水平均顯著升高。模型大鼠肝細胞體積增大，排列不規則，可見少許空泡樣變性，部分肝組織可見局灶性壞死，存在明顯的炎性細胞浸潤，提示大鼠肝組織炎癥損傷明顯，模型建立成功。

TRAF6介導多種生理和病理學過程，在許多具有免疫調節功能的受體家族中被認為是下游因子，在發育、體內平衡和癌癥發生過程中具有重要作用。有研究表明，ConA可誘導AIH并明顯促進TRAF6表達[12]。應用左旋四氫巴馬汀可通過抑制TRAF6/JNK通路的凋亡和自噬作用，減輕ConA誘導的AIH動物的急性肝損傷[13]。TRAF6處理還可顯著提高人腎小球系膜和腎小管上皮細胞IL-1β、IL-6和TNF-α水平[14]。本研究采用脂質體法轉染TRAF6 shRNA，以探討降低TRAF6表達對AIH大鼠的影響，結果表明與模型組比，TRAF6 shRNA處理組大鼠肝組織TRAF6 mRNA水平顯著降低，大鼠肝組織勻漿IL-1β和IL-6水平、血清ALT和AST水平均顯著降低。抑制TRAF6表達后大鼠肝組織細胞水腫減輕，肝組織炎性細胞浸潤明顯減少，提示抑制TRAF6表達可降低AIH大鼠肝組織炎癥水平，改善肝組織損傷。

NF-κB信號轉導缺陷與嚴重的免疫缺陷有關，而該途徑的激活失調是各種自身免疫和炎性性疾病的發病機理[15，16]。炎性細胞因子IL-1與其受體結合后可激活典型的IKK/NF-κB信號傳導，而TRAF6是NF-κB信號轉導的關鍵介質。當其激活時，TRAF6啟動炎癥級聯擴增，導致組織損傷和器官功能障礙[17，18]。有研究發現，ConA誘導AIH小鼠可激活肝臟NF-κB信號，促進肝組織炎癥反應[19]。另有研究發現，TRAF6可通過激活IκB激酶，促進IκB磷酸化及其降解，從而激活NF-κB信號通路，完成下游炎癥信號的傳遞[20]。本研究結果發現，抑制TRAF6基因表達后大鼠肝組織NF-κB信號通路相關蛋白表達均顯著降低，提示抑制TRAF6基因表達可通過抑制p-NF-κB p65和p-NF-κB p50蛋白水平，從而抑制NF-κB信號通路的活化。

綜上所述，抑制TRAF6基因表達可通過降低AIH大鼠肝組織炎癥水平，改善肝組織損傷，其機制可能是抑制了NF-κB信號通路的活化有關。