復合益生菌對K99引起的犢牛腹瀉小腸結構及腸膠質細胞分泌亞硝基谷胱甘肽的影響

劉 彤，徐春生，祁鳳華，袁曉鳳，宋思佳

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003）

0 引言

腹瀉是犢牛常見的一種消化道疾病，常發生在犢牛三周齡左右，多發季節為初春、夏末和秋初，其危害犢牛的健康，治療不及時往往導致犢牛死亡率增加，嚴重影響養牛的經濟效益。生產中常用抗生素治療犢牛腹瀉，而抗生素易產生耐藥性，同時又會殺滅腸道有益菌群，引起腸道功能的紊亂。益生菌預防治療腹瀉是一種安全有效的選擇，益生菌可抑制部分腸道有害菌群，改善腸道內環境穩態，達到治愈腹瀉的作用，且使用安全無殘留。

復合益生菌由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母菌按比例3∶3∶1組成。嗜酸乳桿菌可通過動物胃腸道中微生物的競爭排斥作用，幫助動物建立有益的宿主胃腸道微生物區系，促進動物生長、預防動物疾病。殷金玲等[1]制成的免疫康可以從體液免疫、細胞免疫和單核巨噬細胞系統方面改善小鼠的機體免疫力。枯草芽孢桿菌可以促進動物采食、提高飼料利用率、改善動物胃腸道平衡、增加動物健康等。Lee等[2]研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以促進小腸上皮細胞的生長，增加小腸絨毛高度，提高營養物質的吸收。布拉迪酵母菌可降低畜禽料重比、改善家禽生產性能、降低腹瀉的發生，可促進畜禽腸道有益菌的增殖，產生乳酸從而降低腸道致病菌的含量，進而調節腸道菌群平衡，促進畜禽機體免疫因子的釋放和免疫器官的發育，進一步增強畜禽機體免疫力[3]。

腸膠質細胞（EGCs）是腸神經膠質系統的重要組成部分，其分泌的亞硝基谷胱甘肽（GSNO）具有較好地促進腸黏膜屏障的作用。有關犢牛小腸EGC 分泌GSNO 的研究未見有報道，本試驗應用益生菌作用于K99 感染犢牛，探究益生菌及K99 對犢牛小腸GSNO 分泌的影響，為益生菌在犢牛腹瀉中的應用提供參考資料，亦為EGC 的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物試驗在新疆軍墾曙瑞奶牛場完成，選擇健康，胎次、胎齡相近的荷斯坦公犢牛22頭，體重約為40kg。

1.1.2 試驗試劑無水乙醇、95%乙醇、二甲苯（天津化工有限公司）；石蠟、中性樹膠（上海萬輝儀器有限公司）；牛GSNO 試劑盒（上海酶連生物科技有限公司）；4%的多聚甲醛（賽國科技有限公司）；伊紅、蘇木精（北京索萊寶科技有限公司）。大腸桿菌K99（含菌量為1×109CFU·g-1）和復合益生菌（由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和布拉迪酵母菌按3∶3∶1 比例組成，含菌量為1×109CFU·mL-1）來自石河子大學動物科技學院。

1.1.3 試驗儀器滅菌高壓鍋（江明市東華器械有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱、電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；萊卡石蠟切片機（RM2235）；載玻片、蓋玻片（天津化工科技有限公司）；KD-T電腦生物組織攤烤片機（浙江科迪儀器設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計與飼養管理

犢牛自出生后飼喂足量的初乳及鮮乳。將選擇的22 頭犢牛隨機分為3 組：對照組8 頭，常規飼喂，每日灌服10mL 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）；益生菌組6 頭，在試驗開始第一天飼喂K99 10mL，之后每天飼喂復合益生菌；感染組8 頭，常規飼喂基礎上，每天灌服K99 10mL。試驗期分別為7d、14d和21d，試驗到期之時，于次日清晨晨飼前宰殺。

1.2.2 石蠟切片制作及病理觀察

犢牛頸動脈放血宰殺后，剖開腹腔分別取小腸各段組織樣2cm，PBS 清洗管腔后將組織樣置于中性甲醛固定液中12h，脫水，透明，包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察攝片。

1.2.3 酶聯免疫吸附法（ELISA）法測定犢牛小腸內GSNO的含量

1.2.3.1 樣品采集

分別從對照組、益生菌組、感染組隨機選取5頭牛，分離小腸，截取十二指腸、空腸和回腸段，沖洗掉腸道內容物，于-20℃冰箱保存待測。

1.2.3.2 組織樣品處理

取小腸新鮮組織，用手工或勻漿器將其勻漿充分，4℃條件下3000r離心20min，仔細收集上清液用于分析。

1.2.3.3 ELISA方法

（1）標準品的加樣：設置標準品孔和樣品孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50uL。

（2）加樣：分別設空白孔、待測樣品孔。

（3）加酶：每孔加入酶標試劑100uL，空白孔除外。

（4）溫育：用封板膜封閉后置37℃溫育60min。

（5）配液：用蒸餾水將20 倍濃縮洗滌液稀釋20倍后備用。

（6）洗滌：每孔加滿洗滌液，靜置30s棄去，重復5次，拍干。

（7）顯色：加入顯色劑，37℃避光顯色15min。

（8）終止：每孔加終止液50uL，終止反應。

（9）測定：以空白孔調零，450nm 下依序測量各孔吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15min 內進行。

（10）數據轉換：測量各孔的吸光度（OD 值）轉換成各孔的濃度。

1.3 統計分析

用EXCEL 對數據進行預處理，用SPSS 20.0 對數據進行單因素方差分析，并做多重比較，數據以“均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 犢牛小腸病理切片觀察

2.1.1 十二指腸

如圖1中A1～A3所示可知，對照組犢牛腸絨毛比較完整，無出血現象，有個別絨毛斷裂的情況出現；感染組犢牛腸絨毛結構不完整，絨毛斷裂、脫落，并且有變短、水腫現象，如圖中箭頭所示為絨毛斷裂情況較多，并且較短；益生菌組犢牛腸絨毛較完整，排列比較緊實，結構較為正常。

圖1 犢牛十二指腸病理切片圖Figure 1 Pathological sections of duodenum of calves

2.1.2 空腸

如圖2中B1～B3所示，對照組犢牛腸絨毛比較完整，有個別絨毛斷裂的情況出現；感染組犢牛腸絨毛結構不完整，絨毛斷裂、脫落，并且有變短、水腫現象，箭頭所示為斷裂絨毛，并且較短；益生菌組犢牛腸絨毛較完整，排列較緊實，結構較為正常。

圖2 犢牛空腸病理切片圖Figure 2 Pathological sections of jejunum of calves

2.1.3 回腸

如圖3 中C1~C3 所示可知，對照組犢牛腸絨毛結構比較完整；感染組犢牛腸絨毛結構不完整，絨毛斷裂、脫落，并且有變短、水腫現象，圖中箭頭標示為絨毛斷裂情況，并且較短；益生菌組犢牛腸絨毛較完整，斷裂較少，排列較緊實，結構正常。

圖3 犢牛回腸病理切片圖Figure 3 Pathological sections of ileum of calves

2.2 犢牛小腸內GSNO的含量變化

由表1 所列可知，三組犢牛小腸中GSNO 的含量各有差異，其中十二指腸中GSNO 含量三組處理間無顯著差異；空腸中益生菌組GSNO 含量雖高于對照組，但兩者間無顯著差異（P＞0.05），對照組和益生菌組均顯著高于感染組（P＜0.05）；回腸中益生菌組GSNO 含量高于對照組，但兩者間無顯著差異（P＞0.05），對照組和益生菌組均極顯著高于感染組（P＜0.01）。

表1 犢牛小腸GSNO含量變化（單位：mmol·L-1）Table 1 Changes of GSNO content in small intestine of calves（unit:mmol· L-1）

3 討論

3.1 復合益生菌及大腸桿菌K99 對犢牛小腸形態的影響

大腸桿菌是造成犢牛腹瀉的主要原因之一，已有研究證實犢牛從7 日齡起灌服大腸桿菌K99，其腹瀉率從30%上升到70%，犢牛的腹瀉率顯著提高[4]。張雪[5]研究得出飼糧添加枯草芽孢桿菌可以提高肉雞后期（22—42日齡）生長性能，且全期（1—42 日齡）效果不低于抗生素桿菌肽鋅。盧奇成等[6]的試驗中，在犢牛早期（1—21d）飼糧中補充不同劑量的布拉氏酵母可以降低犢牛的腹瀉率，提高機體的抗氧化能力和免疫力，減少犢牛的腹瀉。羅波文等[7]研究得出一定濃度的嗜酸乳桿菌可以提高細胞的抗氧化能力。邵青玲等[8]研究認為腸絨毛高度是檢驗小腸吸收能力的一個重要指標。

從本試驗HE 染色結果可以看出，對照組犢牛十二指腸、空腸及回腸腸絨毛完整，無出血現象；感染組腸絨毛有明顯的出血現象，絨毛斷裂、脫落，說明大腸桿菌K99在一定程度上會對犢牛腸道造成損傷，引起犢牛腹瀉；而益生菌組腸絨毛結構較完整，無絨毛斷裂、脫落現象，表明益生菌一定程度上促進腸道發育，對腸道有一定的保護作用。在十二指腸、空腸和回腸中，益生菌組的腸絨毛長度高于對照組和感染組，感染組的腸絨毛長度低于對照組，本試驗中感染大腸桿菌K99可導致腸粘膜屏障結構發生變化，引起犢牛腹瀉。而益生菌組腸絨毛較完整，結構正常，說明復合益生菌對腸道有一定的保護作用。

3.2 復合益生菌及大腸桿菌K99 對犢牛小腸內GSNO的影響

GSNO 是 EGCs 中的重要組成成分，而 EGCs 是腸神經系統的重要組成部分，EGCs 的缺失，反映了腸上皮組織屏障的損害，不利于腸道的發育[9]。呂健[10]研究指出源自EGCs 的S-GSNO 是一種新的腸屏障功能誘導物。S-GSNO 對上皮屏障功能的調節，可能是通過對連接體周圍F 肌動蛋白的巰基亞硝基化和改變其表達來完成。本試驗中，與對照組相比，益生菌組小腸中GSNO含量升高，而感染組小腸中GSNO 含量顯著降低，一定程度上反映復合益生菌具有促進犢牛腸道發育的作用。

4 小結

本試驗中，犢牛感染大腸桿菌K99 導致腹瀉發生，而復合益生菌組小腸絨毛較完整，結構正常，說明復合益生菌對腸道有一定的保護作用。并且感染組的GSNO 含量顯著下降，而益生菌組中含量增加，說明GSNO 可在一定程度上保護腸黏膜結構的完整，抑制大腸桿菌K99的致病作用。

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