絲素/細菌纖維素/羥基磷灰石骨仿生支架的制備及性能研究 *

谷敏婧，趙飛翔，范蘇娜, 2，馬 凱，姚 響，張耀鵬, 2

(1. 東華大學 纖維材料改性國家重點實驗室，材料科學與工程學院，上海 201620；2. 濟南金泉生物科技有限公司，濟南 250101； 3. 襄陽市中醫醫院下肢骨科，湖北 襄陽 441000)

0 引 言

骨是一種致密的締結組織，在生命活動中起著重要的作用。正常情況下，骨組織有一定的再生和自我修復能力，但是由于嚴重創傷、腫瘤切除等造成的骨缺損則只能采用骨移植的方法加以修復[1]。目前采用的移植技術存在諸多不足，如二次創傷、并發炎癥、免疫排斥、成骨能力有限等問題[2-3]，而骨組織工程技術的發展為骨修復提供了一種新的治療途徑。已有研究報道表明多種材料均可用于骨組織工程支架[4]，其中絲素蛋白(SF)由于其具有優異的生物相容性、可控的降解性、無免疫源性、優良的加工性等，成為了組織工程支架的理想材料之一[5-8]。然而，研究表明純SF支架在力學性能方面難以匹配骨組織工程的要求[9-10]。細菌纖維素納米纖維束(BCNR)具有良好的生物相容性和優異的機械性能，將其作為增強材料與SF復合，可進一步提升支架的力學性能和孔徑尺寸[11-12]。羥基磷灰石是骨組織中主要的無機成份，而納米羥基磷灰石(nHAp)的組成、晶型和結晶度與天然骨中的羥基磷灰石極其相似，同時還具有較高的比表面積、生物相容性、骨誘導和骨傳導活性等[13-14]。因此，以SF材料為基體，加入BCNR和nHAp，有望制備出結構組成和力學性能均能滿足使用要求的骨仿生組織工程支架。冷凍干燥法操作簡便，可較好地保留原料組份的生物活性和力學性能，再水化后支架也能較好地保持其結構和強度[15]。因此，本文以SF為基體，BCNR為增強材料，輔以骨活性成份nHAp復合，通過冷凍干燥法制備骨仿生支架，分析了復合支架的微觀結構、孔隙率、力學性能、吸水率等性能，驗證了細胞在支架上的黏附和增殖能力。

1 實 驗

1.1 材料及設備

家蠶繭，浙江桐鄉；細菌纖維素，海南椰國食品有限公司；納米羥基磷灰石，美國Sigma公司；無水碳酸鈉，分析純，國藥集團有限公司；溴化鋰，分析純，上海中鋰實業有限公司；透析袋，截留分子量(14 000 ± 2 000)，上海源聚生物科技有限公司；DMEM低糖培養液，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Gibco公司；三抗(青霉素、鏈霉素、兩性霉素B)，美國Gibco公司；CCK-8試劑盒，日本Dojindo公司。

冷凍干燥機，FD-1A-50，北京博醫康實驗儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀(FTIR)，Nicolet 6700，美國Thermo Fisher公司；掃描電子顯微鏡(SEM)，Quanta 250，美國FEI公司；電子萬能材料試驗機，Instron 5969，美國英斯特朗公司；恒溫 CO2培養箱，BB15，德國Heraeus公司；超凈工作臺，BJ-CD Series，上海博訊實業有限公司；酶標儀，Multiskan MK3，美國Thermo公司。

1.2 SF/BCNR/nHAp骨仿生支架的制備

SF水溶液和BCNR的制備過程參照文獻[16]。本文固定兩者的質量比為SF：BCNR=20：3，改變nHAp組份的含量，使其占復合體系總固含量的比例分別為0、20%、30%、40%，所制備的復合支架(composite scaffold，CS)分別簡稱為CS0、CS20、CS30、CS40。具體步驟為先將nHAp加入到12 wt%的SF溶液中，隨后用磁力攪拌器攪拌均勻，再加入BCNR，繼續攪拌，將混合均勻的原料倒入模具中(直徑為18 mm，高度為8 mm的圓柱體)成型，放置在-25 ℃下冷卻處理12 h，再置于-80 ℃條件下冷凍12 h，最后通過冷凍干燥機將樣品凍干。

1.3 支架性能表征

SEM：將制備好的樣品干燥后噴金(電流為10 mA，時間為50 s),在10 kV的電壓下觀察支架的微觀結構。支架的片層厚度和間距由Image J軟件進行測量分析，單個樣品的數據來源于100處測量。

FTIR：將干燥后的支架樣品放在研缽中磨碎，再加入溴化鉀繼續研磨，混合均勻后用磨具壓成薄片，采用壓片法進行測試。掃描的波數范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為16。使用PeakFit軟件對紅外光譜的酰胺I區進行分峰擬合，計算各支架的無規卷曲/螺旋、β-折疊和β-轉角含量。

電子萬能材料試驗機：樣品尺寸：直徑為18 mm，高為10 mm。試驗機上裝載10 kN的傳感器，以3 mm/min的速率進行壓縮。選取所得的應力-應變曲線中應變為40%處的強度作為支架的壓縮強度；支架的彈性模量由應力-應變曲線初始直線部分的斜率得到。

孔隙率測試：將支架樣品干燥后稱重，并計算樣品體積，從而計算出樣品的表觀密度ρa；通過密度儀測試樣品的實際密度ρr，通過以下公式計算支架的孔隙率：

(1)

溶脹率測試：將支架樣品干燥后稱重，記為Wdry，再將各樣品用PBS浸泡，在37 ℃下放置24 h后取出，用濾紙吸干支架表面多余的水分，稱重，記為Wwet。溶脹率通過以下公式計算：

(2)

1.4 兔骨髓間充質干細胞的培養和接種

按照2×104cells/cm2的密度將兔骨髓間充質干細胞接種到培養皿(直徑為10 cm)中進行擴增培養，每皿添加10 mL的培養液。細胞培養液組成如下：500 mL的DMEM低糖培養液、50 mL的胎牛血清和5.5 mL的三抗混合而成。放在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，每兩天全量更換培養液。細胞長滿培養皿80%左右后收集制成細胞懸浮液，選取CS0和CS30為代表性支架材料，將細胞接種到經環氧乙烷滅菌的CS0和CS30復合支架上(1×106cells/支架)，隨后將已接種細胞的支架放到6孔板中(每孔放置1個支架)，放入37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育4 h后，每孔加入6 mL細胞培養液后放入37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中繼續培養，每兩天全量更換一次培養液。

1.5 典型支架材料中的細胞活力檢測

按照CCK-8試劑在細胞培養液中體積比為10%的比例配置CCK-8檢測液，將接種細胞后培養1天和7天的支架樣品(CS0和CS30)取出放入24孔板中，每孔加入1 mL已配好的CCK-8檢測液，放在細胞培養箱中孵育2 h，再將孵育完成的CCK-8溶液部分轉移至96孔板，每孔100 μL，用酶標儀測定OD值。

1.6 數據的統計學分析

實驗數據均采用平均值±標準差的形式，通過Origin中的one-way ANOVA檢驗實驗數據是否具有顯著性差異，p < 0.05表示存在顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 不同nHAp含量對復合支架微觀孔隙結構的影響

支架中孔的幾何特征，包括孔的形態、孔徑、孔隙率、互通性等，是影響組織工程中細胞黏附、遷移、增殖以及營養物質運輸的重要因素[17]。本文采用SEM表征復合支架的形貌結構。由圖1(a)可知，SF/BCNR二元復合支架(CS0)具有明顯的骨仿生片層結構，其中SF作為主體材料，形成骨架片層；BCNR部分貼附在片層表面，部分穿插在片層之間，以增加片層結構的穩定性及支架的機械強度，這與已有文獻報道較為吻合[16]。為進一步提升支架的仿生性能，本文構建了SF/BCNR/nHAp三元復合骨支架。實驗結果表明，nHAp的負載并不會阻礙或破壞骨仿生片層結構，如圖1(a)所示。同時，nHAp顆粒的存在使支架表面更粗糙，理論上將更利于細胞的黏附。對支架的片層結構進行半定量表征，取距支架中心4 mm的位置計算骨仿生支架的片層間距和片層厚度，測量結果如圖1(b)所示，隨nHAp負載量的增加，片層間距明顯增大，從(22.39±6.89)μm(CS0)增大到(72.83±28.14)μm(CS40)，其原因可能是由于nHAp部分穿插在片層間所致。此外，負載nHAp的三元復合支架的孔隙率較SF/BCNR二元復合支架也有明顯提升，在CS30和CS40支架中可達到85%，如圖1(c)所示。統計結果表明，三元復合支架和二元復合支架的孔隙率存在顯著性差異。上述結果表明，具有骨活性nHAp組份的負載不會阻礙或破壞骨仿生片層結構的形成，還可增大片層間距、提升支架孔隙率和表面粗糙度。SF/BCNR/nHAp三元復合進一步提升了骨支架在結構和活性上的仿生程度，有利于促進骨組織的修復和再生能力。

圖1 不同nHAp含量SF/BCNR/nHAp復合支架的微觀孔隙結構(a)SEM圖，(b)片層厚度和間距，(c)孔隙率(*代表數據之間存在顯著性差異，n=3，p<0.05)Fig 1 Microscopic pore structure of SF/BCNR/nHAp composite scaffolds with different nHAp contents: (a) SEM images; (b) Lamellar thickness and interlamellar gap; (c) porosity (* represents the significant difference between the date, n = 3, p < 0.05)

2.2 不同nHAp含量對復合支架二級結構的影響

圖2 不同nHAp含量SF/BCNR/nHAp復合支架的紅外光譜圖(a)紅外光譜圖，(b)二級結構分析(*代表數據之間存在顯著性差異，n=3，p<0.05)Fig 2 FTIR spectra of SF/BCNR/nHAp composite scaffolds with different nHAp contents (a)FTIR spectra; (b) secondary structure analysis (* represents the significant difference between the date, n=3, p< 0.05)

2.3 不同nHAp含量對復合支架力學性能的影響

為滿足骨組織修復的要求，理想的仿生支架材料還需具有完全匹配的力學性能。在本研究中，未添加nHAp時，SF/BCNR二元復合支架CS0的壓縮強度為(2.69±0.22)MPa；添加nHAp后，SF/BCNR/nHAp三元復合支架的壓縮強度先降低后增加，隨后再降低，且CS0和CS20、CS40的壓縮強度具有顯著性差異，如圖3(a)所示。當nHAp的含量為30%時，支架的壓縮強度為(2.08±0.23)MPa，與CS0無顯著性差異，依然在與松質骨匹配的壓縮強度(2～12 MPa)范圍內[20]。另一方面，SF/BCNR/nHAp三元復合支架的彈性模量隨nHAp的添加先增加后減小，如圖3(b)所示。其中CS30的彈性模量最高，為(26.56±2.16)MPa。產生上述結果的原因很可能是nHAp的添加使得支架的片層間距增大，進而導致抵抗壓縮的能力降低；但由于nHAp納米顆粒自身的支撐作用，支架的彈性模量先有所增加，在30%左右達到峰值，隨著含量的進一步增加(40%)，過量的nHAp可能導致納米顆粒聚集，使復合材料的結構不均勻，進而導致支架的彈性模量和壓縮強度都有明顯降低，這與Farokhi等人文獻中nHAp含量的過度增加導致納米顆粒聚集，進而導致SF/nHAp支架力學性能降低的報道較為一致[14]。同時，有研究表明細胞的生長分化能力與組織工程支架的力學性能有密切關系，與骨組織匹配的力學性能可促進骨細胞特異性基因的表達[21-23]。綜合各項力學性能參數，在SF/BCNR/nHAp三元復合支架中，CS30更能匹配松質骨的力學性能要求。

圖3 不同nHAp含量SF/BCNR/nHAp復合支架的力學性能(a)壓縮強度，(b)彈性模量(*代表數據之間存在顯著性差異，n=3，p<0.05)Fig 3 Mechanical properties of SF/BCNR/nHAp composite scaffolds with different nHAp contents: (a) compressive strength; (b) elastic modulus (* represents the significant difference between the date, n=3, p<0.05)

2.4 不同nHAp含量對復合支架溶脹率的影響

骨缺損的修復效果還依賴于營養物質和代謝產物在組織工程支架中的傳輸和交換效率。由圖4可知，加入nHAp后，SF/BCNR/nHAp三元復合支架的溶脹率有一定程度的提升，但各復合支架的溶脹率并無顯著性差異?？赡茉蛟谟趎HAp的負載增大了支架的孔徑和孔隙率，如圖1(b)、(c)所示，進而使得其可容納的水分子增多，連通性增強，從而使溶脹率的平均值有一定提升。高的溶脹率利于營養物質和代謝廢物的輸送，從而利于細胞的黏附和生長[24]。由此可見，負載nHAp的三元復合支架有望更利于細胞的黏附和生長，SF/BCNR/nHAp三元復合支架CS30具有最優的骨組織仿生性能。

2.5 nHAp的負載對復合支架上細胞黏附和增殖能力的影響

支架材料在體外的細胞黏附和增殖能力評估能夠間接反映其在體內對缺損組織的修復潛能。CCK-8試劑盒可簡便準確地檢測支架材料上的細胞活力(同時可間接反映相對細胞數量)。典型支架材料(CS0和CS30)上細胞活力的檢測結果如圖5所示，從1天的結果來看，與CS0相比，CS30上的細胞活力更強，CS0的OD值與CS30的值存在顯著性差異，表明SF/BCNR/nHAp三元復合支架更利于骨髓間充質干細胞的初始黏附。隨培養時間的延長(7天)，相對細胞活力(OD值)明顯增大，表明骨髓間充質干細胞在兩種復合支架上都有明顯的增殖，但CS30上的細胞活力明顯更強，OD值存在顯著性差異。與SF/BCNR二元復合支架CS0相比，SF/BCNR/nHAp三元復合支架CS30更有利于細胞的初始黏附及后續的細胞增殖。該結果證實了具有骨活性成份nHAp的引入提高了支架上干細胞的黏附和增殖能力，進一步提升了三元復合支架的細胞相容性，展現了SF/BCNR/ nHAp三元復合骨仿生支架在骨組織修復方面的潛力。

圖5 細胞在CS0和CS30復合支架上的細胞活力評估(*代表數據之間存在顯著性差異，n=3，p< 0.05)Fig 5 Cell viability assessment of cells on the composite scaffolds of CS0 and CS30 (* represents the significant difference between the date, n=3, p<0.05)

3 結 論

(1)在SF/BCNR二元復合支架的基礎上，骨活性成份nHAp的負載并未阻礙或破壞支架中骨仿生片層結構的形成，對支架中SF的二級結構也無明顯影響，但增大了SF/BCNR/nHAp三元復合支架的孔徑、孔隙率和溶脹率，提升了三元復合支架的仿生程度。

(2)適量nHAp(30%)的加入使三元復合支架CS30的壓縮強度和彈性模量等力學性能能夠更好地匹配松質骨的力學性能要求。

(3)與SF/BCNR二元復合支架相比，骨活性成份nHAp的加入明顯提高了骨髓間充質干細胞在SF/BCNR/nHAp三元復合支架上的黏附和增殖能力，體現了該支架在骨組織修復方面的潛力。