核酸檢測在血液傳染病篩查的應用價值*

李廣波，軒乾坤，羽曉瑜，溫冬華，楊思敏

(同濟大學附屬東方醫(yī)院檢驗科，上海 200123)

乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)是經(jīng)血液傳播的主要病原體，其感染亦是目前較為嚴重的公共衛(wèi)生問題。醫(yī)療單位常將這3種病原體和梅毒作為有創(chuàng)診療和輸血前常規(guī)檢測的病原體。目前常用ELSIA或電化學發(fā)光等檢測這些病原體的抗原或抗體。新發(fā)感染后抗原或抗體的檢測需要較長的窗口期，而病原體核酸檢測可明顯縮短窗口期。文獻報道HIV感染后1～2周(平均11 d)可檢測到HIV RNA，3～4周(平均22 d)可檢測到抗HIV；HCV感染后1～2周(平均12 d)可檢測到HCV RNA，2～3個月(平均70 d)可檢測出抗HCV；HBV感染后最早33 d可檢測出HBV DNA，2個月(平均56 d)可檢測出HBsAg[1]。因此病毒核酸檢測可明顯提前確認患者的感染狀態(tài)，能有效控制傳染病，預防疾病傳播的發(fā)生。目前醫(yī)院很少將核酸檢測應用于手術前和輸血前篩查，本文探討核酸檢測在血液傳染病篩查的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018-2019年在本院住院因手術或輸血需要檢測乙肝五項和抗HCV、HIV抗原抗體的500例患者血清標本。分離血清，留取1.5 mL做核酸檢測，其余用于化學發(fā)光檢測抗原抗體。

1.2 方法

1.2.1核酸篩查檢測下限驗證

陰性血清將WHO標準物質(zhì)(HBV：NIBSC code10/266，HCV：NIBSC code 14/150，HIV：NIBSC code 16/194)稀釋到試劑說明書注明的檢出限濃度，即HBV DNA 5 IU/mL、HCV RNA 50 IU/mL、HIV RNA 50 IU/mL。每批試驗重復檢測4次，重復檢測5批，分別統(tǒng)計5批試驗樣品陽性檢出率，陽性樣品統(tǒng)計CT值的CV值，陽性檢出率大于或等于90%，CT值CV<5%為驗證通過。

1.2.2病毒抗原抗體檢測

使用羅氏cobas e602免疫化學發(fā)光儀及羅氏配套試劑檢測患者血清乙肝五項，抗HCV、HIV抗原抗體。

1.2.3病毒核酸定性檢測

使用上海科華公司的HBV、HCV、HIV(1型)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)的提取試劑盒和擴增檢測試劑盒。使用HAMILTON的MICROLAB STAR核酸提取儀提取核酸，伯樂CFX Connet PCR儀定性檢測HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA。結(jié)果判定標準按照試劑盒說明書。

1.2.4病毒核酸定量檢測

比對每份樣品HBsAg、抗 HCV、HIV抗原抗體的結(jié)果與核酸定性檢測結(jié)果是否一致。結(jié)果不一致的原始標本使用羅氏COBASAmpliPrep-COBAS TaqMan(CAP-CTM)系統(tǒng)定量檢測核酸水平。

2 結(jié) 果

2.1 檢測下限驗證

HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA檢測下限分別為5 IU/mL、50 IU/mL、50 IU/mL，見表1。

表1 檢測下限驗證結(jié)果

2.2 化學發(fā)光和核酸檢測結(jié)果比較

檢測出11例HBV化學發(fā)光與核酸定性結(jié)果不一致標本，未檢出HCV、HIV化學發(fā)光與核酸定性結(jié)果不一致標本，見表2。

表2 化學發(fā)光和核酸檢測結(jié)果比較

2.3 確認實驗

2例HBsAg陽性HBV DNA篩查陰性標本，確認實驗顯示HBV DNA定量小于檢測限。9例(1.8%)HBsAg陰性HBV DNA篩查陽性標本，1例定量為23.6 IU/mL,6例可見擴增曲線定量小于檢測限，2例無擴增曲線，見表3。

續(xù)表2 化學發(fā)光和核酸檢測結(jié)果比較

表3 乙肝五項、HBV DNA定性及定量結(jié)果

3 討 論

目前臨床常用化學發(fā)光或ELISA方法檢測乙肝五項、抗HCV、HIV抗原抗體確認患者的感染情況。因病毒復制周期及感染者免疫狀態(tài)個體差異，從感染到檢測陽性存在長短不一的窗口期。隨著分子診斷技術的發(fā)展，有效利用PCR的高靈敏度和高特異性，可大大縮短窗口期。目前HBV DNA和HCV RNA定量檢測在臨床已廣泛應用，但其檢測下限較高，常見試劑檢測下限HBV DNA 為100 IU/mL，HCV RNA為1 000 IU/mL，可用于治療監(jiān)測，但不適合常規(guī)感染篩查。HIV RNA定量或定性檢測未普遍應用于臨床。本研究定性檢測下限HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA分別為5、50、50 IU/mL，較定量檢測大幅降低，這種極低的檢測下限能更好地檢測處于窗口期和低拷貝感染者。

本研究共檢測500例血清標本，共檢測出HBsAg陰性HBV DNA篩檢陽性9例(1.8%)，遠高于血站檢測的陽性率。上海地區(qū)的HBsAg陰性獻血人群中HBV DNA陽性感染率為0.049%[2]，北京地區(qū)無償獻血者感染率為0.05%[3]，閩南地區(qū)同類研究報道為0.2%[4]。其原因可能為研究對象不同，本研究樣本量較小，地區(qū)人群HBsAg流行差異及檢測HBsAg和HBV DNA所采用的檢測試劑不同。獻血者多為身體健康的青年人，本研究患者多為重病需要手術或輸血的中老年患者。HCV RNA和HIV RNA未檢出陽性樣品，與這兩種病原體在人群中的流行率較低及本試驗檢測樣品數(shù)量較少有關。目前公認的HBV DNA定量檢測“金標準”是羅氏公司COBASAmpliPrep-COBAS TaqMan(CAP-CTM)定量檢測系統(tǒng)，其檢測下限為20 IU/mL。本研究檢出1例23.6 IU/mL標本，8例可見擴增曲線但定量低于20 IU/mL。2例HBsAg陽性HBV DNA定性陰性標本可見擴增曲線但定量低于20 IU/mL，分析原因可能為定性檢測下限(5 IU/mL)附近的低拷貝樣品。HBsAg陰性HBV定量檢測陽性的7例標本中1例乙肝五項全部陰性疑似HBV感染窗口期，其余6例為HBsAb、HBeAb、HBcAb中1項或多項陽性的多種不同組合，與文獻報道結(jié)果相似[5-6]。若HBV患者和無癥狀攜帶者血清中HBsAg檢測結(jié)果呈陰性，而血清或肝臟中HBV DNA檢測結(jié)果呈陽性，被稱為隱匿性HBV感染(occult HBV infection，OBI)[7-8]。本研究中低于定量檢測下限(20 IU/mL)的6例患者疑似為OBI，1例患者(5號病例)為疑似窗口期感染，但并未進一步追蹤并確認。

手術因有創(chuàng)操作等可能增加患者院內(nèi)感染HBV、HCV、HIV的風險，臨床通常要求手術或輸血患者輸血前檢測乙肝五項、抗HCV、HIV抗原抗體以避免不必要的醫(yī)療糾紛，評估對患者實施創(chuàng)傷操作醫(yī)務人員感染的風險。醫(yī)務工作者發(fā)生職業(yè)暴露后可根據(jù)暴露源病毒核酸檢測結(jié)果評估風險，為緊急藥物處理等提供更準確而及時快速的支持。研究表明我國1～59歲普通人群HBsAg陽性率為 7.18%[9]。血液透析人群由于經(jīng)常暴露在血液環(huán)境、頻繁穿刺、共用透析設備及免疫力降低等原因，成為HBV感染的高危人群，我國血液透析人群 HBsAg 陽性率為11.9%，遠高于普通人群[10-11]。HBV、HCV、HIV病原體核酸檢測的高靈敏度和避開窗口期為透析患者的分區(qū)隔離管理提供了有力保障。1996-2016年國內(nèi)有關HCV感染暴發(fā)事件的文獻報道因血液透析發(fā)生 HCV 感染暴發(fā)事件10起，不安全注射導致HCV感染暴發(fā)事件3起，輸血或單采血漿導致 HCV 感染暴發(fā)事件4起[12]?？笻CV檢測是目前國內(nèi)篩查HCV感染的主要方法，在臨床工作中，通常對抗HCV篩查陽性者才進行HCV RNA檢測，很大程度上可能漏檢了一部分處于血清轉(zhuǎn)換期的HCV感染者，而給其他透析患者帶來了很大的風險[13-14]。HBV、HCV、HIV病原體核酸檢測可縮短窗口期，減少此類不良事件的發(fā)生。

臨床醫(yī)生可根據(jù)實際需求選擇各有優(yōu)缺點的血清學和核酸檢測篩查血液傳染病，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，還原患者病原體感染的真實狀況，有助于疾病診斷、病情監(jiān)測、療效評價、判斷預后，有利于評估有創(chuàng)操作職業(yè)暴露的風險。