三陰乳腺癌中MIR892B和CDK1的基因拷貝數變異與患者惡性進展的相關性分析*

王智輝，鐘媚共，孟子杰，伍婉婷，陳秋旋，鄭 焱，張 鑫△

(1.廣東省江門市中心醫院腫瘤科 529030；2.廣東省江門市婦幼保健院藥學部 529000；3.廣東省江門市中心醫院醫學研究中心 529030；4.廣東省人乳頭狀瘤病毒(HPV)相關疾病分子診斷工程技術研究開發中心，廣東潮州 521021)

乳腺癌(breast cancer)是最常見的女性特發惡性腫瘤，其發病率居首位，且呈上升趨勢，嚴重威脅女性健康[1-2]。按浸潤性生長狀態，可分為原位癌和浸潤癌，并以浸潤性乳腺導管癌(infiltrating ductal carcinoma of breast,IDC)為臨床的主要病理類型[3]。雖然外科手術依然是治療浸潤性乳腺癌的基礎，但是對于進展期及復發轉移的乳腺癌，化療、內分泌治療及靶向治療等的系統治療手段更為重要[4]。然而，有類特殊亞型的乳腺癌——三陰乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的腫瘤生物學特征更為惡性，且因缺少靶點，無法使用內分泌治療藥物及常規靶向藥物，5年內發生術后進展情況較其他亞型嚴重[5-6]，是乳腺癌臨床治療中的瓶頸。臨床診治中，TNBC屬排除性分類，為雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)及人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)陰性，HER2編碼基因ERBB2無擴增的浸潤性乳腺癌[3]。研究指出[3,5,7]，TNBC占全部浸潤性乳腺癌的10%～20%，我國及非洲裔人TNBC的比例較其他國家或種族高。在預后觀察中，TNBC的特點是有較高的5年內進展率(約25%)，而較為穩定的長期(10～20年)無進展率(約70%)[8]，導致部分患者迅速進展的機制依然不清，也少見基因組拷貝數變異(copy number variations,CNV)在TNBC惡性進展中的作用報道。因此，本課題組將嘗試利用全基因組CNV分析結合臨床樣品驗證，找出與TNBC惡性進展相關的基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料

參考本課題組已發表文獻[9]，下載癌癥基因組圖譜數據庫(the cancer genome atlas,TCGA)中乳腺癌的基因組拷貝信息(由Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片過濾得到)及對應樣品的臨床信息，數據庫的更新下載時間為2020年1月31日。利用臨床信息中ER、PR和HER2的免疫組織化學染色結果及ERBB2DNA原位雜交結果，篩選出ER和PR免疫組織化學為陰性，同時HER2免疫組織化學陰性或ERBB2非擴增的TNBC 153例。在GenePattern公共服務器平臺(https://genepattern.broadinstitute.org/)上，利用GISTIC 2.0軟件分析腫瘤組織的全基因組拷貝信息，其中原始拷貝數信息源自TCGA下載整理，參考基因組為人類19版基因組(human genome 19,hg19)，探針標記的物理位點信息(Markers file)和CNV參照信息(CNV file)均整理自SNP Array 6.0的第35版本信息(http://www.affymetrix.com/)；關鍵的運行參數均為默認，并分析X染色體的CNV情況。運行所得的關鍵數據：(1)每個探針標記位點的擴增或缺失情況，即G評分，G評分的高低能綜合反映該位點的擴增或缺失的深度和頻率；(2)每個樣品中單個基因的CNV情況，包括缺失、二倍體和擴增。

收集整理2012年1月至2015年12月在江門市中心醫院就診的TNBC患者88例資料，均為手術標本，鑒別診斷參考已發表文獻及共識。

兩群樣品在性別、年齡、病理類型及TNM臨床分期的分布差異均無統計學意義(P>0.05)，但在5年內的預后事件發生情況上有差異(P<0.001)，原因是TCGA的5年內隨訪并不完善，見表1。

表1 TCGA及江門市中心醫院TNBC患者的基本信息

續表1 TCGA及江門市中心醫院TNBC患者的基本信息

1.2 qPCR檢測石蠟標本的CDK1基因和MIR892B基因CNV

參考本課題組已發表文獻[9]，調取患者手術標本中腫瘤成分70%的石蠟組織，10 μm厚度切片4張。按GeneRead DNA FFPE試劑盒操作說明書提取石蠟切片的DNA；利用TaqMan Copy Number Assay的熒光定量PCR引物Hs02504302_cn檢測CDK1基因拷貝數，引物Hs05702773_cn檢測MIR892B基因拷貝數，其中內參引物為TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P，二倍體參考樣品為健康人血漿白膜層樣品，擴增試劑盒為TaqMan Fast Advanced Master Mix，按說明書在CFX96熒光定量PCR儀中檢測。規定樣品中目標基因的相對拷貝數檢測值小于0.75為缺失，大于1.50為擴增，其余為二倍體。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism7.0統計軟件進行分析。計數資料以頻數表示，采用χ2檢驗或Fisher′s精確檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier分析方法及log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義(P<0.05)。

2 結 果

2.1 TCGA中TNBC預后相關的擴增區段分析

通過GISTIC 2.0軟件分別對TCGA中27例5年無進展和32例5年有進展的TNBC患者腫瘤組織進行全基因組CNV分析，結果顯示3p26.1、10q21.2和19q12在有進展腫瘤組織中明顯擴增，6p21.1、11q13.4和Xq27.3在無進展腫瘤組織中明顯擴增，見圖1。

2.2 TCGA中TNBC預后相關的缺失區段分析

32例5年有進展患者腫瘤組織存在明顯缺失情況的染色體區段為4p13和12q24.32，在27例5年無進展患者腫瘤組織中發生明顯缺失的為13q22.2和19p13.3，見圖2。

2.3 TCGA中各CNV熱點基因與5年進展事件的相關性

利用IGV軟件并結合文獻報道，確定各區段的擴增或缺失關鍵基因：3p26.1為堿性螺旋-環-螺旋家族成員基因E40(BHLHE40)、6p21.1為細胞周期蛋白D3(CCND3)、10q21.2為細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、11q13.4為微小RNA-139(MIR139)、19q12為細胞周期蛋白E1(CCNE1)、Xq27.3為微小RNA-892B(MIR892B)、4p13為泛素C末端水解酶L1(UCHL1)、12q24.31為跨膜蛋白132B(TMEM132B)、13q22.2為泛素C末端水解酶L3(UCHL3)和19p13.3為絲氨酸/蘇氨酸激酶11(STK11)。只有MIR892B的擴增情況能夠在TCGA中顯著區分TNBC患者的5年無進展預后(χ2=4.300，P=0.038)。進一步利用兩兩組合的方式顯示，將MIR892B的非擴增或CDK1的擴增作為陽性指標，能更好地區分TNBC患者的5年無進展預后(P=0.008)，見表2。

表2 TCGA中各CNV熱點基因與5年內進展事件的相關性[n(%)]

2.4 TCGA中CDK1和MIR892B CNV與患者無進展預后的相關性

將MIR892B的非擴增或CDK1的擴增患者定義為指標陽性組(n=115)，余下的為指標陰性組(n=26)，指標陽性組的無進展預后要明顯差于指標陰性組(P=0.010)，見圖3。

圖3 TCGA中無進展預后曲線圖

2.5 江門市中心醫院樣品中CDK1和MIR892B CNV與5年進展事件的相關性

在江門市中心醫院樣品中分別檢測了CDK1和MIR892B的CNV，只有MIR892B的擴增情況能夠顯著區分患者的5年無進展預后(χ2=4.616，P=0.032)，將MIR892B的非擴增或CDK1的擴增作為陽性指標，能更好地區分TNBC患者的5年無進展預后(P<0.001)，見表3。

表3 CDK1和MIR892B的拷貝數變異與5年進展事件的相關性[n(%)]

2.6 江門市中心醫院樣品中CDK1和MIR892B CNV與患者無進展預后的相關性

在江門市中心醫院TNBC患者的癌組織中，將MIR892B的非擴增或CDK1的擴增患者定義為指標陽性組(n=68)，余下的為指標陰性組(n=20)，指標陽性組的無進展預后明顯差于指標陰性組(P=0.001)，見圖4。

圖4 江門市中心醫院樣品中無進展預后曲線圖

3 討 論

近二十年來，精準醫學從概念逐步走到臨床，乳腺癌的診治就是其發展的范例之一；將分子特征檢測技術與傳統腫瘤病理診斷相結合，有力地推動了乳腺癌的精準診治，成熟的乳腺癌分子特征主要包括了關鍵驅動基因的突變、CNV及蛋白產物的異常表達等。在關鍵驅動基因的CNV中，癌基因ERBB2的擴增在乳腺癌中最具有臨床意義，一方面，ERBB2的擴增是明確的乳腺癌患者不良預后的標志物，是癌蛋白HER2過表達的主要原因[10]；另一方面，針對HER2蛋白為靶點的曲妥珠單抗，在治療轉移性HER2過表達型乳腺癌中療效確切，能有效延長相適應分型患者的生存時間，而ERBB2的擴增檢測是重要的伴隨診斷檢查[11]。但是對于TNBC，暫時未見可以用于診治的關鍵驅動基因CNV特征，探討與TNBC預后相關的CNV具有潛在的臨床應用開發價值。

一般認為，腫瘤基因組中發生擴增的區段一般包含了重要的癌基因，而缺少的區段則往往含有關鍵的抑癌基因[12]。利用基因組瀏覽器及文獻調研，筆者分別確定了各個區段的熱點基因，在進展組中發生明顯擴增的是與細胞周期運行密切相關的CDK1(10q21.2)和CCNE1(19q12)[13]，被證實與乳腺轉移密切相關的轉錄因子BHLHE40(3p26.1)[14]，發生明顯缺失的有泛素化途徑相關基因UCHL1(4p13)和跨膜蛋白TMEM132B(12q24.31)；在無進展組中發生明顯擴增的是周期相關蛋白CCND3(6p21.1)和兩個明確的起抑癌作用的MIR139(11q13.4)[15]、MIR892B(Xq27.3)[16]，發生明顯缺失的為泛素化途徑相關基因UCHL3(4p13)和蛋白激酶STK11(19p13.3)。預后相關性分析發現，僅MIR892B的非擴增與TNBC患者5年進展預后相關，且MIR892B擴增及CDK1非擴增的TNBC患者具有好的無進展預后，而這一結果在江門市中心醫院樣品中得到了驗證，表明了MIR892B的擴增是TNBC患者好的預后相關因子，而CDK1的擴增是TNBC患者差的預后相關因子。CDK1作為細胞周期調控相關蛋白，在S期與Cyclin A結合參與細胞S～G2期轉換，在G2期與Cyclin B結合參與細胞G2～M期轉換，是腫瘤細胞周期運行及增殖的關鍵蛋白，也是新型抗腫瘤藥物開發的重要靶點[17]，但是關于CDK1的CNV在惡性腫瘤中的診斷報道較少。本研究發現，CDK1的擴增能影響TNBC患者預后，但相關性較MIR892B的非擴增差，提示在TNBC惡性進展中MIR892B的作用更明顯。

在前期研究中，筆者率先報道[16]了miR-892b在乳腺癌組織及細胞中表達明顯下調，且其表達越低患者的臨床分期越高、生存預后越差；在體內外實驗中，抑制miR-892b能促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲、皮下成瘤及肺定殖生長，過表達則起抑制作用，其作用機制可能與miR-892b能同時靶向抑制維持NF-κB通路激活的負調控因子TRAF2、TAB3和TAK1有關。前期，筆者觀察到miR-892b編碼基因MIR892B的啟動子位置有甲基化位點，其在乳腺癌中低表達的原因與啟動子甲基化有關[16]，而本研究顯示，MIR892B(Xq27.3)在TNBC腫瘤組織中存在擴增，而MIR892B(Xq27.3)的擴增是與TNBC好的預后相關，進一步說明了miR-892b的低表達與乳腺癌特別是TNBC患者差的預后相關。近期，在非小細胞肺癌中筆者觀察到具有抑癌活性的肝性白血病因子(hepatic leukemia factor,HLF)，其低表達同時受編碼基因的CNV和啟動子甲基化水平調控，綜合兩因素的聯合指標更能反映HLF的表達水平[9]。MIR892B的CNV與啟動子甲基化的聯合指標是否能預測TNBC患者的預后是課題組后續的研究方向。