高效液相色譜法測(cè)定銀杏芪血通膠囊中阿魏酸和芍藥苷的含量

河南省商丘市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（476000）王飛 蔣俊春

醫(yī)院制劑是醫(yī)療機(jī)構(gòu)為了滿(mǎn)足病人的需要制定的制劑，其靈活性大、適應(yīng)性強(qiáng)，尤其適用于效期不長(zhǎng)，穩(wěn)定性弱的小批量生產(chǎn)的制劑。但是隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，醫(yī)院對(duì)藥品質(zhì)量的要求越來(lái)越高，藥品質(zhì)量的管理已逐步走向正規(guī)化，在新形勢(shì)下，醫(yī)院制劑的問(wèn)題也越來(lái)越多地暴露出來(lái)。銀杏芪血通膠囊是河南省柘城縣人民醫(yī)院的醫(yī)院制劑，具有顯著的補(bǔ)氣活血，散淤通絡(luò)的功效，廣泛用于各種心腦血管疾病。它的處方中有十二味中藥，而制劑標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)人參、當(dāng)歸和川芎三味藥進(jìn)行了薄層色譜鑒別，對(duì)該制劑的質(zhì)量控制不夠嚴(yán)格[1][2][3]。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，本文建立了高效液相色譜法測(cè)定銀杏芪血通膠囊中阿魏酸和芍藥苷含量的方法，通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證[4]，表明該方法準(zhǔn)確，易于操作，有利于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司]，XS 205DU電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），SB-800DTD超聲處理機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥 阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110773-201614）；芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110736-201741）；乙腈為高效液相色譜專(zhuān)用，水為超純水。銀杏芪血通膠囊（河南省柘城縣人民醫(yī)院，批號(hào)：200107、200509、200806）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18色譜柱（4.6×150mm，5um）。流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)附表1）；流速1.0ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm；進(jìn)樣量10μl；理論板數(shù)應(yīng)不低于2000，分離度大于1.5。

附表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取阿魏酸對(duì)照品約15mg，精密稱(chēng)定，置50ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使其充分溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。另稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置20ml量瓶中，同法制成芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1ml、芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液5ml，置于同一10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品2粒的內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇10ml，稱(chēng)定重量，超聲處理30min后，冷卻至室溫，補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，續(xù)濾液用0.45um的微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 將處方中除了當(dāng)歸、川芎和赤芍的其他味藥，按照制備工藝制成陰性制劑，并按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，色譜圖見(jiàn)附圖。供試品溶液的色譜圖中主峰與對(duì)照品溶液的色譜圖主峰的保留時(shí)間一致，且阿魏酸與芍藥苷色譜峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，達(dá)到基線(xiàn)分離，陰性無(wú)干擾；按阿魏酸或芍藥苷峰計(jì)算，理論塔板數(shù)大于5000。

附圖 高效液相色譜圖

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 取阿魏酸與芍藥苷混合對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，取對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣1、2、5、10、20μl，記錄阿魏酸和芍藥苷峰面積值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為：Y=0.02729X+0.01324，相關(guān)系數(shù)為1.0000，Y=11.56581X-0.06011，相關(guān)系數(shù)為0.9999，Y為峰面積，X為對(duì)照品進(jìn)樣量。結(jié)果可見(jiàn)：芍藥苷對(duì)照品進(jìn)樣量在0.2530～5.060ug，阿魏酸對(duì)照品進(jìn)樣量在0.02862～0.5724ug之間與峰面積積分值線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μl，記錄主峰面積，阿魏酸和芍藥苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.77%、0.82%（n=6），由此可證精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在12h內(nèi)每隔1h進(jìn)樣測(cè)定一次，記錄測(cè)定結(jié)果，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，阿魏酸為1.04%，芍藥苷為0.98%，表明供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液5份，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果阿魏酸的平均含量為0.1426mg·粒-1，RSD為1.65%(n＝5)，芍藥苷的平均含量為1.2417mg·粒-1，RSD為1.46%(n＝5)，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取供試品（阿魏酸含量為0.1426mg·粒-1、芍藥苷為1.2417mg·粒-1）1粒的內(nèi)容物（平均粒重0.4g），研細(xì)，精密稱(chēng)定，9份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.40ml、0.50ml、0.60ml和芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液2.00ml、2.50ml、3.00ml各三份，再加入甲醇適量使其成為10ml，稱(chēng)定重量，超聲處理30min后，冷卻至室溫，補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，續(xù)濾液用0.45um的微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)附表2。

附表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定 按照本文建立的方法測(cè)定3批樣品，結(jié)果見(jiàn)附表3。

附表3 3批樣品中阿魏酸和芍藥苷的含量測(cè)定

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的確定 本文分別比較了甲醇、乙醇、水、70%的乙醇溶液和80%的甲醇溶液的提取效率和主要有效成分色譜峰的各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果以甲醇為溶劑提取的效果最好[5-8]。分別采用了超聲和回流的方法進(jìn)行提取，結(jié)果顯示超聲提取30min，能夠較充分地將有效成分提取出來(lái)，且操作簡(jiǎn)便，回收率高。

3.2 色譜條件的選擇[9]兩種成分同時(shí)測(cè)定，故選用梯度洗脫程序，采用二極管陣列檢測(cè)器，分別考察了甲醇-0.1%的磷酸溶液、乙腈-0.1%的磷酸溶液和乙腈-水等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果采用了乙腈-0.1%的磷酸溶液梯度洗脫程序，兩主要色譜峰峰形較好，分離的達(dá)到要求，且陰性無(wú)干擾。