水肥脅迫對不同尾葉桉無性系葉綠素熒光特性的影響

楊會肖，廖煥琴，楊曉慧，徐 放，張衛華，潘 文

（廣東省林業科學研究院/廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣東 廣州 510520）

【 研究意義】 尾葉桉屬雙蒴蓋亞屬（Symphyomyrtus subgenus）橫脈組（TransversariaSection），天然分布于印度尼西亞弗洛勒斯、愛羅瑞島、朗伯萊島、潘塔島、艾道尼瑞島、韋塔島及東帝墳的帝漢島。目前，桉樹產業包括種苗、肥料、制材、制漿造紙、人造板、生物質能源和林副產品等產業鏈，年總產值在3 000 億元以上。桉樹產業不僅在保障我國木材安全問題上發揮了巨大作用，也在天然林資源保護、林農脫貧致富、鄉村振興等方面做出了重要貢獻。【前人研究進展】自20 世紀80 年代在華南地區開展種源試驗以來，尾葉桉逐漸成為華南地區的主要栽培樹種。目前尾葉桉及其雜種無性系人工林面積已達95 萬hm2，占我國華南地區桉樹人工林面積60%，是該地區重要的紙漿材造林樹種之一。植物正常生長的環境因子主要包括水分和養分，在水分和養分受到限制的條件下，合理的水肥配置才能顯著地提高植物生產力［1-2］。國內外對桉樹研究主要集中在引種、育種［3-4］、栽培［5-6］和木材特性［7］等方面，而對桉樹在不同水肥條件下光合生理特性的研究甚少。葉綠素熒光動力學技術被稱為測定葉片光合功能快速、無損傷的探針［8］，多應用于光合作用機理、植物抗逆生理、農林物增產潛力預測等方面［9］，但有關水肥脅迫處理下葉綠素熒光特性對尾葉桉無性系的綜合質量評價的研究還未見報道。

【本研究切入點】本試驗采用人工控制水分和養分的方法，研究水肥脅迫對19 個尾葉桉無性系生長、葉形和葉綠素熒光參數的影響，通過系統評價不同水分和養分條件下尾葉桉生長、葉形和葉綠素熒光參數的差異，以及相關性、主成分和聚類分析，以期為高光效親本的選擇和高效優質栽培提供理論依據。【擬解決的關鍵問題】針對我國南方桉樹人工林無性系單一、品種衰退明顯、病蟲害發生日趨嚴重，急需選育優良品種對現有栽培品種進行替換的需求，結合生長、葉形和葉綠素熒光特性綜合性狀評價，篩選適合不同水肥條件下生長的尾葉桉無性系，或利用傳統育種與現代育種相結合的手段進一步改良尾葉桉親本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016 年4—10 月在廣東省林業科學研究院后山苗圃內（113°23'，E23°14'N）進行。該區屬于典型亞熱帶季風氣候，年降水量1 638 mm，年平均溫度23 ℃，海拔25 m，最低1 月平均氣溫13.3 ℃，最高8 月平均氣溫38.1 ℃，年平均濕度為79%。供試尾葉桉無性系19 個，其來源見表1。

表1 19個尾葉桉無性系基本信息Table 1 Basic information of 19 clones of Eucalypyus urophylla

1.2 試驗方法

試驗采用2 因素（水分、養分）3 水平完全隨機區組設計，選取生長一致的19 個尾葉桉（Eucalyptus urophylla）無性系幼苗（平均苗高為70 cm）移栽到圓形控根器容器中。試驗設9個水分養分處理，分別為處理11（低水分低養分）、處理12（低水分正常養分）、處理13（低水分高養分）、處理21（正常水分低養分）、處理22（正常水分正常養分）、處理23（正常水分高養分）、處理31（高水分低養分）、處理32（高水分正常養分）、處理33（高水分高養分）。具體水分梯度參照楊會肖等方法［10］。養分處理分為基肥和追肥兩種處理，其中以鈣鎂磷和復合肥為基肥肥料，追肥以尿素和復合肥為肥料。水肥處理自緩苗期1 月后進行控制。

低養分處理基肥施鈣鎂磷肥250 g/盆；正常養分處理基肥施鈣鎂磷肥250 g/盆，追肥1 次，施復合肥150 g/盆；高養分處理基肥施鈣鎂磷肥250 g/盆和復合肥150 g/盆，追肥2 次，分別施尿素100 g/盆和復合肥150 g/盆。

1.3 葉綠素熒光參數測定

于2016 年10 月中旬對尾葉桉生長、葉片形態和葉綠素熒光參數進行測定，其中生長和葉片形態具體測定及分析參照楊會肖等［10］方法。葉綠素熒光參數測定選擇在晴朗天氣上午9:00～11:00和下午14:00～16:00，采用LI-COR 公司生產的LI-6800 型便攜式光合測定儀，每個植株選取3～5 片完全展開的功能葉片，測量前將樣品用錫紙包裹，暗適應處理20 min 后測定各項熒光指標，每個葉片重復測定3 次。首先測定暗適應葉綠素熒光參數包括初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、最大PS Ⅱ光能轉化效率（Fv/Fm））；再打開活化光（1 500 μmol/m2· s）活化20 min，測定光適應下的參數，包括凈光合速率（Pn）、初始熒光（Fo′）、光適應下最大熒光（Fm′）、光適應下穩態熒光（FS）、光適應下最大可變熒光（Fv′），計算光化學淬滅系數（qP）、非光化學猝滅系數（NPQ）、表觀量子傳遞速率（ETR）及實際光化學效率（ΦPSⅡ）等參數。

1.4 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2020進行整理，采用R 軟件進行分析，不同水肥及無性系間平均值的比較采用最小顯著差數法（LSD）進行多重比較，生長、葉片形態和葉綠素熒光參數間采用Pearson 相關分析法，無性系間的聚類分析采用最短距離和歐式距離聚類法。

2 結果與分析

2.1 水肥脅迫對尾葉桉生長性狀的影響

由圖1可知，在不同水肥條件下，尾葉桉樹高、地徑和冠幅之間發生明顯變化，樹高由小到大依次為處理11 ＜31 ＜21 ＜12 ＜32 ＜13 ＜22 ＜23＜33，9 個處理間差異均達顯著水平，其中處理33 的樹高比處理11 高134%；地徑由小到大依次為處理11 ＜31 ＜21 ＜12 ＜32 ＜22 ＜13 ＜23＜33，除處理11 和22 的差異不顯著外，其他處理間差異均達顯著水平，其中處理33 的地徑比處理11 和22 高136%；冠幅由小到大依次為處理11 ＜31 ＜21 ＜12 ＜32 ＜22 ＜13 ＜33 ＜23，9 個處理間差異均達顯著水平，其中處理23 的冠幅比處理11 高100%。

圖1 水分和養分互作對尾葉桉生長量的影響Fig.1 Interactive effects of water and nutrient on growth yield of Eucalyptus urophylla

2.2 水肥脅迫對尾葉桉葉綠素熒光參數的影響

植物對光能的利用可通過葉綠素熒光參數的變化來反映。由表2 可知，在低水分處理下，施入低量的養分時，不同尾葉桉無性系間的初始熒光（Fo）、PSII 實際光化學效率（ΦPSⅡ）、光化學熒光猝滅系數（qP）和電子傳遞量子產量（ETR）差異均達到顯著水平，其他葉綠素熒光參數間差異不顯著，其中2、3、5、6、8、9、13、15、16、14 和18 號無性系的4 個葉綠素熒光參數均無顯著差異，無性系1 的4 個葉綠素熒光參數比無性系10 分別高2.5%、155.6%、111.5% 和161.8%；施入正常量的養分時，不同無性系的最大熒光（Fm）、qP和NPQ差異均達顯著水平，而其他葉綠素熒光參數差異未達顯著水平，其中無性系16 的Fm比無性系9 高45.1%，無性系1的NPQ比無性系4 高109.5%，無性系4 的qP比無性系16 高171.4%。在低水分處理下，施入高量的養分時，不同無性系的Fo、Fm、ΦPSⅡ、qP、NPQ和ETR差異均達到顯著水平，其中無性系17 的ΦPSⅡ、qP和ETR分別比無性系10 高288.9%、187.5% 和278.1%，無 性 系4 的Fo比無性系15 高23.2%，無性系12 的Fm 比無性系14 高21.6%，無性系13 的NPQ比無性系15 高101.7%。

表2 19個尾葉桉無性系在低水分條件下的葉綠素熒光參數Table 2 Chlorophyll fluorescence parameters of 19 clones of Eucalyptus urophylla under low water stress

由表3 可知，在正常水分處理下，不同尾葉桉無性系高養分處理的所有葉綠素熒光參數差異均未達到顯著水平。當施入低量的養分時，Pn以無性系4 最大、無性系3 最小，Fo 以無性系2 最大、無性系10 最小，其他無性系間差異未達顯著水平；ΦPSⅡ、qP和ETR分別以無性系11、4 和11 最大，均以無性系3 最小。當施入正常量的養分時，NPQ以無性系7、11 和14 最大，無性系4最小。

由表4 可知，在高水分處理下，施入低量的養分時，不同尾葉桉無性系的Fo、Fm和Fv/Fm差異均達顯著水平，其中Fo以無性系4、5 最大，無性系14 最小；Fm以無性系5 和10 最大，無性系14 最小；Fv/Fm以無性系2、3、5、10、12 和13 最大，無性系9 最小。在高水分處理下，施入正常的養分時，不同尾葉桉無性系的ΦPSⅡ、qP、NPQ和ETR差異均達顯著水平，其中無性系13 的ΦPSⅡ、qP和ETR比 無 性 系12 分 別 高633.3%、316.7%和625.4%，NPQ則比無性系12低192.2%。在高水分處理下，施入高量的養分時，Pn以無性系10 最大，無性系8 最小；Fo以無性系8 最大，無性系16 最小；ΦPSⅡ、qP和ETR以無性系18 最大，無性系8 最小，無性系18 的ΦPSⅡ、qP和ETR分 別 比 無 性 系8 高320.0%、206.7%和329.2%。

表4 19個尾葉桉無性系在高水分條件下的葉綠素熒光參數Table 4 Chlorophyll fluorescence parameters of 19 clones of Eucalyptus urophylla under high water stress

2.3 尾葉桉生長、葉形與葉綠素熒光參數的相關性和主成分分析

由表5 可知，除平均鮮重、平均干重和平均厚度外，尾葉桉無性系生長與葉形的相關性呈極顯著正相關，相關系數為0.23～0.46,；生長與熒光參數（Pn、Fm'和Fs）均呈極顯著相關，其中與Pn呈負相關，相關系數為0.19～0.21，與Fm'和Fs呈正相關，相關系數為0.16～0.21；熒光參數（Pn、Fm'和Fs）與葉形大部分性狀呈顯著負相關，相關系數為0.14～0.23；NPQ僅與ETR極顯著相關，Pn與ΦPSⅡ、qP、qN呈顯著或極顯著相關，Fo、Fm、Fm'、Fs、ΦPSⅡ、qP與qN均呈顯著或極顯著負相關，相關值介于-0.24～0.96。由此可見，尾葉桉同種類型（生長性狀間、葉形間和熒光參數）性狀間的相關系數較大，而不同類型性狀間（生長與葉形、生長與熒光參數、葉形與熒光參數）的相關性達到了顯著水平，但相關值較小。

由于不同類型性狀間的相關系數較低，因此對尾葉桉生長、葉形與葉綠素熒光參數26 個性狀進行主成分分析，結果（表6）顯示，在第1主成分中葉面積、葉片長、葉周長、平均鮮重、平均干重、葉片寬和平均葉柄長占有較高系數，方差貢獻率為39%，說明第1 主成分是表示葉子大小和重量的綜合因子；在第2 主成分中Fm'、Fs和地徑占有較高系數，方差貢獻率為32%，說明第2 主成分是表示葉綠素熒光和生長的綜合因子；在第3 主成分中平均厚度、地徑、樹高和冠幅占有較高系數（呈異號），方差貢獻率為13%，說明第3 主成分是表示生長和葉片厚度的綜合因子；在第4 主成分Pn、ΦPSⅡ、ETR、Fm和Fo占有較高系數，方差貢獻率為9%，說明第4 主成分是表示光合速率和葉綠素熒光參數的綜合因子。前4 個主成分的累積方差貢獻率為93%，包含了26 個指標的大部分信息，因此選取前4 個主成分作為尾葉桉生長、葉形和葉綠素熒光參數性狀選擇的綜合指標。由此可知，尾葉桉生長、葉形和葉綠素熒光參數性狀之間的差異主要表現為葉面積、葉片長、葉周長、平均鮮重、平均干重、葉片寬、平均葉柄長、平均厚度、地徑、樹高、冠幅、Pn、ΦPSⅡ、ETR、Fm、Fm'、Fs和Fo的不同。

表6 尾葉桉無性系生長、葉形與葉綠素熒光參數的主成分分析Table 6 Principal component analysis of seedling growth,leave shape and chlorophyll fluorescence parameters of Eucalyptus urophylla clone

2.4 聚類分析

以尾葉桉在不同水肥脅迫條件下的生長量（地徑、樹高和冠幅）、葉片性狀（葉面積、葉片長、葉周長、平均鮮重、平均干重、葉片寬、平均葉柄長和平均厚度）和葉綠素熒光參數（Pn、ΦPSⅡ、ETR、Fm、Fm'、Fs和Fo）為參數，采用最短距離和歐式距離聚類法對19 個尾葉桉無性系進行聚類分析，結果（圖2）顯示，18 個生長、葉形和葉綠素熒光參數性狀能將19 個尾葉桉無性系完全區分，說明這些性狀能反映各樣品間的差異。取閾值為10 時，19 個尾葉桉無性系可分為4 組，第1 組包含3 份材料，約占總樣本數的15.8%；第2 組可分為2 個亞組，包含8 份材料，約占總樣本數的42.1%；第3 組包含3 份材料，約占總樣本數的15.8%；第4 組包含5 份材料，約占總樣本數的26.3%。由此可見，19 個尾葉桉無性系具有各自的生長、葉形和葉綠素熒光參數表型特征，可為尾葉桉種內和種間雜交育種親本的選擇提供參考。

圖2 基于生長、葉形和葉綠素熒光參數19 個尾葉桉無性系聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 19 clones of Eucalyptus urophylla based on growth,leave shape and chlorophyll fluorescence parameters

3 討論

N 是植物體內分布最廣的營養元素之一，是植物生長的必需養分，同時也是合成葉綠素的組分元素，當植物缺N 時，體內葉綠素含量下降，葉色發黃，光合作用強的羧化效率度減弱，光合產物減少，從而使作物產量降低［11］。隨著N 元素的增加，植物可溶性蛋白含量及Rubisco 含量增加，從而增加植物的光合速率。P 對植物體內許多重要化合物的組成及多種營養代謝有重要作用，因此P 元素的提高對植物光合速率有重要意義。K 呈離子狀態溶于植物汁液中，在植物中主要起催化作用，能夠促進光合作用，缺K 使光合作用減弱。水分脅迫不僅影響植物光合作用中的光合電子的傳遞、光合磷酸化等過程，也直接引發光合機構的損傷［12］，因此，水肥控制能夠在一定程度上改善植物生存環境，增加植物光合速率，提高產量。

植物體內葉綠素熒光作為快速探針在鑒定、評價植物抗逆性方面的應用越來越多。葉綠素吸收的光能主要通過光合電子傳遞、葉綠素熒光發射和熱耗散3 種途徑消耗［13］，3 種途徑存在此消彼長的關系。因此，可利用葉綠素熒光參數研究水肥脅迫下植物光合作用和熱耗散的情況。本研究中，19 個尾葉桉無性系在水肥脅迫下葉綠素熒光參數Fo、Fm、ΦPSⅡ、qP、NPQ、ETR和Fv/Fm均差異顯著，但不同水肥處理條件下，達到顯著差異的熒光參數有很大不同。Fo增加或減少不僅反映PS Ⅱ反應中心不易逆轉的破壞或天線色素的熱耗散增加，而且Fo與葉片葉綠素濃度有關［14］。在不同水分條件下，Fo在低養分處理下都達到了顯著差異，這可能與低養分的植株葉片偏紅而葉綠素濃度較低有關，具體原因需進一步分析。Fv/Fm 是近年來常用的研究植物對逆境響應的重要生理參數，是植物發生光抑制最明顯的特征［8,15］。在19 個尾葉桉無性系中，無性系2、8、9、12 和17 在水肥處理21 和32 下的值低于0.75，說明這些無性系PS Ⅱ的最大光化學效率受水肥脅迫的影響較大。不同水肥脅迫處理下無性系5 和10 的Fv/Fm值高于其他無性系，說明其PS Ⅱ反應中心的光能捕獲效率高，能更有效地將光能轉化為其生長所需的化學能［16-17］。

相關性分析表明，尾葉桉無性系在不同水肥脅迫處理6 個月后苗木的樹高、地徑和冠幅與Fm、Fv/Fm、ΦPSⅡ和ETR呈顯著或極顯著正相關，說明尾葉桉無性系的葉綠素熒光參數與其生長表現密切相關，光合活性越強，生長表現則越好，這與張培等［18］和張杰等［19］的研究結果相似。非光化學淬滅NPQ用來評價植物耗散過剩激發能的能力，尾葉桉無性系的樹高、地徑和冠幅與NPQ呈負相關，但相關系數未達到顯著水平；葉周長和葉面積與Fo達到顯著負相關，而Fo是代表色素所吸收的全部光能中不參與光化學反應的一部分能量，Fo升高說明色素吸收的光能參與光化學反應的能量減少，以熱量和熒光形式散失的部分增加。呂芳德等［20］發現不同無性系紅山茶Fo與葉綠素含量有關，但植物葉尖角、葉片長、葉片長/寬、葉周長和葉面積與葉綠素熒光參數之間的相關研究未見報道。楊會肖等［10］以生長和葉片形狀為依據，從20 個尾葉桉無性系中選擇了4 個優良無性系，其樹高、地徑和冠幅比對照分別高5.0%、12.8%和14.5%。本研究與上述參試的無性系相同，從光合生理角度出發，無性系5（LDUA10）和10（LDUA24）具有較強的光化學特性。由此可見，不同水肥脅迫下的尾葉桉無性系的選擇可結合生長量、葉形和葉綠素熒光特性，使優良無性系選擇更加可靠。

4 結論

桉樹是華南地區最重要的產業化樹種。本研究結果表明，19個尾葉桉無性系在不同水肥處理下的葉綠素熒光參數差異顯著，以高水高肥處理對不同無性系ΦPSⅡ、ETR的影響更加顯著。尾葉桉同種類型性狀間的相關系數較大（最高0.99），而不同類型間的相關性雖達到顯著水平但相關值較小（最高僅為0.21）。主成分分析表明，前4個主成分的累積方差貢獻率為93%，19個尾葉桉無性系具有各自的生長、葉形和葉綠素熒光參數表型特征，其中無性系5（LDUA10）和10（LDUA24）生長表現好且具有較強的光化學特性，可作為優良無性系在生產上推廣應用。