一株溶磷促生菌的分離、鑒定及其對玉米幼苗生長的影響

張芬芬，周曉倫，賀洋洋

（甘 肅醫學院臨床醫學系/基礎醫學院，甘肅 平涼 744000）

【研究意義】糧食生產對人類生存至關重要，玉米（Zea maysL.）是世界重要的糧食作物之一，廣泛應用于工業、養殖業以及畜牧業中［1］。氮、磷參與植物光合作用、營養吸收、細胞分裂和生物氧化等重要代謝途徑，是植物生長發育所必需的大量營養元素［2］。為了滿足農作物生存、生產所需的氮、磷等營養元素，幾乎所有的土壤都需要化肥來補充無機磷支持作物生產，但反復使用化肥會導致土壤結構惡化［3］，而且土壤中95%的磷的存在形式難以被植物吸收利用［4］。因此，分離和利用土壤溶磷微生物，促進植物吸收磷元素，應用微生物肥料替代部分化肥逐漸成為現代農業技術的研究熱點。植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）是指定殖于植物根際系統，并能促進植物生長和提高產量的一類細菌的總稱［5］。PGPR 在促進作物固氮能力、改善土壤環境以及提高植物抗病抗逆能力等方面有重要研究意義［6］。【前人研究進展】有研究報道關于植物根際促生菌的固氮、溶磷、產氨作用，溶磷菌可以釋放有機酸、螯合和離子交換使土壤中的不溶性磷轉化成可溶性磷，以提高土壤肥力［7-9］。溶磷劑對糧食和飼料作物也有部分相應的促進作用［10-12］。大量的文獻主要說明了根際促生菌其自身的促生作用和菌株的生理特征，但促生菌對植株-土壤-微生物整個體系作用的研究相對很少［13］。【本研究切入點】隴東地區對PGPR 菌株作為生物菌肥應用到農作物中以及促生效應的研究甚少。篩選一批促生作用顯著的根際植物促生菌，可為進一步利用微生物-植物促生相互作用促進農作物的增長，提供優質的菌種資源，提高糧食產量，減少化學肥料對土壤特征的影響。【擬解決的關鍵問題】為探索PGPR對土壤中無機磷的溶磷能力以及植物的促生作用機制，本試驗以冬小麥根際土壤為研究材料篩選具有溶磷能力和產生促生效應物質的菌株，采用改良的Belimov 方法獲得一株顯著促進玉米幼苗生長的菌株，通過16S rRNA 基因序列及表型分析鑒定其為Pseudomonassp，其作為優質的菌種資源，可促進農作物產量的提高和改善局部土壤的理化特征，擴大了生物菌肥的資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土樣采集自冬小麥根際土壤5～15 cm 的土層。

試驗使用的化學藥品均為分析純，均由西安姚北生物科技有限公司提供。

LB固體培養基：胰蛋白胨10.00 g，酵母膏5.00 g，NaCl 10.00 g，瓊脂20.00 g，H2O 1 L，調節pH 為7.0，用于觀察溶磷菌的菌落特征。

改良SRSM 培養基［14］：瓊脂15 g，Glucose 10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO40.004 g，FeSO40.002 g，NaCl 20 g，Yeast extract 0.5 g，Bromocresol purple 0.1 g，加蒸餾水至1 L，調節pH 為6.8～7.0，用于溶磷菌株的分離、純化。

1.2 溶磷菌株篩選

取采集的冬小麥根際土壤10 g，加入到100 mL（含有25～35 個玻璃珠）的LB 液體培養基的錐形瓶中，置振蕩器上震蕩15 min，得到10-1 濃度的土壤稀釋液，連續稀釋至10-6，將10-1～10-6梯度的土壤稀釋液均勻涂布于SRSM 培養基中，培養溫度為30（±2）℃，倒置、恒溫培養3～5 d。菌落周圍若出現溶磷圈即為溶磷菌，挑取具有明顯溶磷圈的菌株進行純化，重復3 次，直至顯微鏡中觀察出現形態、大小一致的細菌。將其保存4℃備用。

1.3 溶磷菌株鑒定

1.3.1 菌株形態觀察及生理生化試驗 菌落形態特征及革蘭氏染色特性參照《常見細菌系統鑒定手冊》進行觀察，菌株的各項生理生化指標參照《伯杰細菌鑒定手冊》及相關文獻鑒定［15］。

1.3.2 16S rDNA 序列測定及系統發育樹構建 分別提取菌株的總基因DNA，采用16S rDNA 通用引物27f（5'-AGAGTTT-G-ATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR 擴增，將PCR 產物送西安擎科生物公司完成16S rDNA 擴增及序列測定。提交菌株的16S rDNA序列到NCBI 網站，與已知的序列比對分析其同源性。利用Blast 將序列進行比對，MEGA5.05 分子進化遺傳分析軟件分析堿基組成、GC 含量，Kimura2 參數計算遺傳距離，采用NJ 鄰近法構建系統發育樹。

1.4 溶磷菌株ACC 脫氨酶酶活性和產IAA 能力測定

參照 Penrose 等［16］的方法，ACC 脫氨酶的活性通過ACC 脫氨酶分解ACC 產生的α-酮丁酸來測定。菌體蛋白含量根據Bradford［17］的方法測定。根據α-酮丁酸和蛋白質的標準曲線即可測算ACC 脫氨酶的活性。

參照Glickman 等［18］的方法，將分離純化的菌株分別接種于添加 L-色氨酸、終濃度為0.5 g/L 的LB 液體培養基中，37 ℃、180 r/min 震蕩培養2 d，離心后取50 μL 上清液加入等體積Sackowcki's 顯色劑，在白瓷板上避光顯色30 min后觀察，若顯示粉紅色即為陽性，表明該菌株能夠分泌IAA。

定量測定：取陽性菌株的上清液與Sackowcki's 顯色劑避光顯色30 min 后的混合液，測定在530 nm 的吸光值，以空白培養基作對照，標準曲線以純IAA 的吸光值制作，計算各反應中的陽性菌株產IAA 的量（μg/mL）［19］。

1.5 根際細菌溶磷能力測定

1.5.1 定性測定 待測菌株在改良SRSM 固體培養基上活化，然后用接種針點接菌株至改良的SRSM固體培養基，每菌株在一個皿上接4個重復，在30 ℃培養箱中培養8 d 后觀察菌株周圍是否有透明圈產生。

1.5.2 定量測定 不加磷的改良SRSM 液體培養基100 mL 分裝在250 mL 三角瓶中，滅菌后精確加入0.5 g 滅菌的Ca3（PO4）2粉、1 mL（1×108CFU/mL）培養24 h 菌液，28 ℃、120 r/min 搖床培養，分別在48、72、96、120、144 h 測定菌株溶解無機磷能力［14］。吸取2 mL 混勻菌株培養液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液采用鉬銻抗比色法測定其溶磷量［20］，同時用酸度計測定培養液的pH 值。每菌株3 次重復，以基礎培養基（不接種菌株）為對照。根據磷酸二氫鉀標準曲線確定菌株的溶磷量。

1.6 溶磷菌株對玉米幼苗生長的 影響

于2019 年5—6 月進行盆栽試驗，供試土壤來自平涼農田，供試作物為玉米。試驗設接種ZX-10、ZX-3、ZX-40、ZX-7、ZX-701、ZX-2020、ZX-30、ZX-401 及不接種任何菌劑對照9個處理，5 次重復。供試菌株分別活化后置于LB培養基振蕩培養24 h，用無菌水調節菌懸液濃度為1×108CFU/mL，采用灌根方式進行接種，接 種量10 mL/株。自然條件下室內培養，每隔5 d重復處理1 次，整個試驗期間保持土壤濕潤，30 d 后收獲植株測定生物學數據。

試驗數據采用SPSS13.0 one-way ANOVA 進行分析，采用Fisher's Student-Newman -Keulsa,b進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 溶磷菌株的篩選

將分離純化的菌株以稀釋涂布的方式接種于改良SRS M 固體培養基5 d 后，測定菌落直徑和溶磷圈直徑，根據溶磷圈大小篩選到8 株具有溶磷能力的菌株，其對應平板上都觀察到明顯的溶磷圈。其中，ZX-2020 菌落直徑為2.3 mm，溶磷圈直徑為4.8 mm（圖1 中箭頭所示），計算得SI=2.08，為8 株菌株中最大，因此對ZX-2020 平板上的溶磷菌株進行純化和傳代培養，表明菌株純度和溶磷能力穩定。

圖1 菌株ZX-2020 的溶磷圈Fig.1 Phosporous-solubilizing halos of strain ZX-2020

2.2 溶磷菌株的菌體形態特征和生理生化特性

菌株ZX-2020 為乳白色或淡黃菌落，表面光滑，半透明，濕潤粘稠，圓形，邊緣規則，革蘭氏染色陰性，具運動性。生化反應結果見表1。另外，在SRSM 液體培養基中，菌株ZX-2020 在pH 6.5～11.5 之間均可生長，在37 ℃下生長狀況最好。根據菌體形態特征和生理生化，菌株 ZX-2020 為Pseudomonasspp.

表1 溶磷菌株Pseudomonas sp.ZX-2020 的形態特征和生化反應Table 1 Morphological characteristics and biochemical reactions of Ps eud omonas sp.strain ZX-2020

2.3 菌株ZX-2020 16S rDNA 序列測定

為了鑒定菌株的生理生化特性，以菌株ZX-2020 的總DNA 為模板，利用細菌16S rDNA 引物進行PCR 擴增，得到長度約為1.5 kb 的擴增產物。將此序列提交至Genbank，獲得的登錄號為MT084758。根據Genbank 序列同源性比較，利用NCBI 數據庫提供的Blast 功能進行核苷酸比對，結果顯示，菌株ZX-2020 與Pseudomonas aeruginosastrain P1（MK881024.1）、Pseudomonas aeruginosastrain LCS1（MK430420.1）及Pseudomonas aeruginosastrain BUYA-2（MN490066.1）的16S rDNA 基因序列一致性均高達100%。根據16S rDNA 基因序列的相似性，利用MEGA5.0 構建系統發育樹（圖2），顯示菌株ZX-2020 在系統發育上最接近于銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas aeruginosa）。

圖2 基于菌株ZX-2020 16S rDNA 基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA gene sequence of strain ZX-2020

2.4 菌株ZX-2020 ACC 脫氨酶活性和產IAA能力

植物促生菌可以定植在植物的根以及種子表面，菌株產生的1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶可降解乙烯的前體1-氨基環丙烷-1-羧酸，從而降低乙烯在植物體內的含量，促進植物的生長和發育。IAA 也可通過直接刺激植物細胞的延伸和分裂，促進植物的生長并提高植物自身的防御系統。試驗結果顯示，Pseudomonasspp.ZX-2020溶磷量為198.26（±10.04）μg/mL，ACC 脫氨酶活性為152.62（±7.21）μmol/mg·h，產IAA 量為6.71（±0.32）mg/L，具有較高的產IAA 能力。

2.5 菌株ZX-2020 溶磷能力

難溶性磷在酸性土壤中會轉化成磷酸鋁和磷酸鐵，在石灰性土壤中會轉化為磷酸鈣，而溶磷微生物能把此類難溶性磷轉化成植物可以吸收利用的有效磷。為了 分析測試菌株ZX-2020 轉化土壤中難溶性磷酸鹽并且改善土壤的供磷能力，將菌液與供試土壤按照10%的比例進行混合，3 d后，土壤中的有效磷含量從最初的8.63 mg/kg 上升為12.66 mg/kg。起初的土壤有效磷含量比較少，屬于低能力供磷水平，在施加菌株ZX-2020 后，土壤有效磷含量明顯增加，達到中等供磷水平，證明菌株ZX-2020 可以改善土壤的供磷水平。

2.6 菌株ZX-2020 對幼苗生長的影響

通過不同溶磷菌株對幼苗進行灌根處理，30 d 后測定植株的生理生長指標。盆栽試驗顯示，與對照相比，接種ZX-7、ZX-2020、ZX-30、ZX-401 菌株的幼苗根長均顯著增長，接種ZX-40、ZX-2020、ZX-30、ZX-401 菌株的幼苗莖長均顯著增長，接種ZX-40、ZX-701、ZX-30、ZX-401、ZX-2020 的幼苗鮮重均顯著增加，接種ZX-10、ZX-7、ZX-2020 菌株的幼苗葉面積均顯著增加（表2）。表明接種8 種菌株的玉米幼苗根長、莖長、鮮重、葉面積均有不同程度的增加，以ZX-2020 菌株的促生效應更為突出，接種ZX-2020 菌株的玉米幼苗根長增長54.49%，莖長增長26.96%，鮮重增加1.93%，葉面積增加36.06%。同時，接種溶磷菌株的幼苗植株與對照相比根部生長更為旺盛，根毛數更多，根須更長，根系更為發達。

表2 8 株溶磷菌株對玉米幼苗生長的影響Table 2 Effects of 8 phosphorus-solubilizing strains on the growth of Zea mays L. seedlings

3 討論

土壤、根系及微生物三者相互作用的區域稱為植物根際［21］，植物根系可分泌大量的糖類、氨基酸、激素和維生素，根際細菌的定植在土壤養分轉化和溶解等方面發揮著至關重要的作用［22］。大多數的解磷、溶磷菌都可以促進作物生長、提高作物產量、增強抗病力［23］，假單胞菌屬作為主要溶磷微生物之一，很多研究都表明假單胞桿菌屬菌株對難溶性磷酸鹽有較好的溶磷效果。郭瑩等［24］研究表明銅綠假單胞菌JM1對 磷酸鈣和磷酸鋁的溶磷量分別達到240.63 和2.73mg/L。孫珊等［25］篩選的一株假單胞菌屬菌株CJT-1 對磷酸鈣和宜昌磷礦粉的溶磷量分別達到224.51 和120.59 mg/L，劉輝等［26］篩選的一株熒光假單胞菌JW-JS1 對磷酸鈣的溶磷量最高達708.34 mg/L。本研究篩選得到的ZX-2020 菌株對磷酸鈣溶的溶磷量為198.26 mg/L，該菌株對難溶性磷酸鹽的溶解能力與上述報道的結果相近，甚至效果更優。溶磷菌的溶磷機理非常復雜，有的溶磷菌通過釋放質子來降低土壤pH 值而達到降磷效果，部分溶磷菌通過分泌有機酸而起到溶磷作用，也有溶磷菌通過分泌磷酸酶來溶磷，或者是多種機制并存起到的綜合作用［27-28］。目前，大部分研究認為真菌溶磷的能力主要與其向培養基中分泌的小分子有機酸有關，分泌有機酸一方面可以降低培養基pH利于難溶性磷酸鹽的溶解，另一方面可以通過結合鐵鎂鈣鋁等離子將磷酸鹽釋出來［29-30］，因此造成不同濃度的溶磷菌株溶解能力的差異可能與金屬離子的螯合能力不同或其分泌的有機酸含量有關。溶磷菌劑的使用，直接增加其在土壤中的數量，有利于植物對磷素的吸收利用［31］。萬水霞等［32］通過盆栽試驗，發現土壤根際篩選出的優良PGPR 菌株（CH70）對莧菜的株高及地上部鮮重都有一定的促進作用，并且從根際土壤分離獲得的溶磷菌株，其菌劑能有效促進苗期生長和增加產量［33］。陳佳怡等［34］對水稻根際土壤進行溶磷菌篩選純化，分離得到的假單胞菌有高效的溶磷能力，可用來研制微生物菌肥。在隴東地區，過量使用化肥使農業生態環境遭到破壞，迫切需要綠色高效的生物菌肥代替化肥，因此，在今后的研究中，改善土壤微環境，溶磷微生物能夠推動土壤中有效磷的釋放，從而促進植物生長發育，增加作物產量，篩選更多優良PGPR 菌株尤為重要。

4 結論

本研究從平涼市化肥施用冬小麥土壤中初步篩選分離得到8 株溶磷菌株，通過植物促生試驗得到一株溶磷能力強（198.26 mg/L）、產吲哚乙酸（6.71 mg/L）、ACC 脫氨酶活性強（152.62 μmol/mg·h）的銅綠假單胞菌屬，可以作為生物菌肥應用到農耕活動中，不但可以增加農作物對磷元素的吸收，而且吲哚乙酸也可以促進植物的生長，ACC 脫氨酶可以幫助植物抵抗非生物脅迫條件，如重金屬、干旱、高鹽等，增加植物的抗逆性。當ZX-2020 菌株進入土壤中定殖于植物根系后，產生的吲哚乙酸、ACC 脫氨酶和溶解無機磷的能力相互作用，促進植物生長，提高農作物的生物量，同時也為化肥土壤的生物修復提供了菌種資源。