UCH37與PRDX1相互作用影響肝癌細胞遷移和侵襲的機制研究

劉海寧 張寧萍 王 平 唐文清 劉韜韜 沈錫中 方 穎

原發性肝癌(以下簡稱為肝癌)是世界范圍內的高發腫瘤，其中70%～90%為肝細胞癌(HCC)[1]。肝癌在全球男性惡性腫瘤年發病率中居第5位，惡性腫瘤病死率中居第2位；肝癌在全球女性惡性腫瘤年發病率中居第9位，惡性腫瘤病死率中居第6位[1]。中國肝癌的發病率遠高于其他國家，給家庭和社會帶來了沉重的負擔。肝癌復發是影響肝癌術后生存時間的重要因素，是肝癌切除術后致死的主要原因。對于肝癌術后復發和轉移的中晚期患者，目前唯一有效的靶向治療藥物索拉菲尼也只能延長約3個月的生存期[2]。因此，亟需探索肝癌術后復發和轉移的分子機制，以期尋找新的可早期診斷肝癌術后復發和轉移的生物學標志物。

泛素羧基末端水解酶37(UCH37)是一種去泛素化酶，通過泛素-蛋白酶體降解途徑參與蛋白質的降解。過氧化物酶1(PRDX1)是PRDX家族的一員，可有效消除活性氧，在氧化應激中起著至關重要的作用。本課題組的前期研究發現，UCH37和PRDX1分別在肝癌組織中呈高表達和低表達，與肝癌術后預后不良相關；UCH37和PRDX1分別能促進和抑制肝癌細胞的遷移和侵襲；此外，還發現PRDX1與UCH37相互作用后可影響由UCH37所致的促進肝癌細胞遷移和侵襲的能力[3-4]。c-Myc屬于Myc蛋白家族成員，在多種惡性腫瘤細胞中呈高表達。文獻報道，PRDX1可通過結合c-Myc的Myc 盒Ⅱ(MB Ⅱ)結構域，特異性抑制c-Myc的轉錄活性，從而發揮抑制腫瘤進展的作用[5-6]。本研究進一步探索UCH37與 PRDX1相互作用后通過c-Myc促進肝癌細胞遷移和侵襲的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

293T細胞購自中國科學院上海生命科學研究院。小鼠抗人UCH37單克隆抗體、小鼠抗人PRDX1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗人UCH37多克隆抗體購自美國Abcam公司，轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，蛋白酶抑制劑MG132購自德國Merck公司，BCA蛋白質定量檢測試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，蛋白A-瓊脂糖購自美國Roche公司。

1.2 轉染

將細胞按5×105個/孔接種于6孔板內，待生長匯合到75%密度時，按照Lipofectamin 2000試劑盒說明書進行如下轉染。將10 μL Lipofectamine 2000滴加至90 μL無血清培養基中，混勻，室溫孵育5 min。將10 μL稀釋的質粒滴加至90 μL無血清培養基中，混勻。將含有質粒和Lipofectamine 2000的無血清培養基混勻，室溫孵育20 min。換2 mL無血清培養基，將Lipofectamine 2000和質粒混合物加入6孔板培養皿中，混勻。在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養5 h，換有血清培養基，并觀察熒光以確定轉染效率。48 h后收集細胞，提取蛋白行蛋白質印跡法(Western blotting)檢測。

1.3 Western blotting檢測

收集細胞前12 h，在培養基中加入10 μmol MG132以減少細胞蛋白降解。離心收集細胞，加適量細胞裂解液裂解細胞，收集細胞裂解液，冰上預冷30 min后，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，收集細胞蛋白。用BCA蛋白質定量檢測試劑盒對細胞蛋白進行定量分析。取適量蛋白加5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水煮8 min，使之變性。蛋白樣品在12%的分離膠中電泳數小時后轉移到NC膜上。將膜置于5%牛奶封閉液中，在室溫下封閉1 h，置入適量一抗溶液，4 ℃孵育過夜。次日，洗膜，加入適量二抗溶液，室溫孵育1 h，放入儀器中曝光并記錄圖片。

1.4 免疫共沉淀

先對蛋白A-瓊脂糖進行預處理：將蛋白A-瓊脂糖混勻，加入1 mL 1×PBS，4 ℃ 3 000 r/min離心2 min，棄去上清，重復3次。收集細胞蛋白，加入適量一抗溶液，4 ℃旋轉10 h。加入適量已預處理的蛋白A-瓊脂糖，4 ℃旋轉過夜。次日將混合物于4 ℃ 3 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復3次，最終獲得免疫共沉淀的沉淀物，用于Western blotting檢測。

1.5 細胞免疫熒光及激光共聚焦實驗

在24孔板中接種細胞，待細胞貼壁后棄去培養基，用1×PBS輕輕洗1遍。將預先混合好并冰浴的丙酮、甲醇混合液(以體積1∶1混合)加入細胞培養板孔中，室溫放置2 min，吸棄混合液，用1×PBS輕輕洗3遍。在細胞培養板孔中，加入溶于1×PBS的5%胎牛血清溶液，37 ℃恒溫箱中封閉1 h。PBS-T(1×PBS中加入0.2% Triton X-100)沖洗3次，加入適量一抗溶液，4 ℃孵育過夜。加入不同熒光標記的二抗溶液，37 ℃恒溫箱中避光孵育1 h。用DAPI溶液進行細胞核染色，PBS-T洗滌3次。取出蓋玻片，用熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結果

2.1 UCH37高表達后PRDX1與c-Myc的結合情況

在本課題組的前期研究中，免疫共沉淀和激光共聚焦結果已證實UCH37與PRDX1之間存在相互作用[4]。本研究中探討了UCH37、PRDX1和c-Myc之間的關系。免疫共沉淀結果顯示UCH37與c-Myc、PRDX1與c-Myc之間存在相互結合(圖1A、1B)，激光共聚焦結果顯示UCH37和c-Myc共定位于細胞核內(圖1C)。隨后，在6孔板中種植293T細胞，待細胞長至75%密度時轉染質粒。第1個孔轉染PRDX1質粒3 μg，第2個孔轉染PRDX1質粒3 μg和c-Myc質粒2 μg，第3、4、5個孔在轉染PRDX1質粒3 μg和c-Myc質粒2 μg的基礎上再分別轉染UCH37質粒1 μg、3 μg和6 μg。通過PRDX1抗體進行免疫共沉淀，檢測與其結合的c-Myc強度，結果顯示隨著UCH37轉染質粒量的梯度增高，用相同量的PRDX1進行免疫共沉淀后，與PRDX1結合的c-Myc蛋白表達量逐漸降低(圖1B)。

注：Flag為融合了Flag標簽蛋白；HA為融合了HA標簽蛋白；IP為免疫共沉淀；IB為蛋白質印跡；WCL為全細胞溶解；s.e.為短時間曝光；l.e.為長時間曝光

2.2 UCH37高表達后PRDX1的表達情況

在上述實驗中獲取的細胞總蛋白行Western blotting檢測，結果顯示，隨著UCH37的梯度表達增高， PRDX1蛋白表達量逐漸降低(圖2A)。神經前體細胞表達發育調控蛋白4(NEDD4)蛋白屬于含HECT結構域的泛素E3連接酶。本研究通過免疫共沉淀及激光共聚焦技術，發現UCH37與NEDD4之間存在相互作用(圖2B、2C)。此外，還發現過表達NEDD4后，PRDX1的泛素化水平明顯增高(圖2D)。由此可見，UCH37高表達后，通過NEDD4對PRDX1泛素化降解增加而使其呈低表達。

注：Input為陽性對照；CTRL為陰性對照

2.3 UCH37高表達后細胞核內c-Myc蛋白表達情況

本研究進一步探討了c-Myc在細胞內的表達情況。激光共聚焦結果顯示，PRDX1在細胞核和細胞質內均有表達，c-Myc主要在細胞核內表達，兩者共定位于細胞核內(圖3A)。在6孔板中種植293T細胞，待細胞長至75%密度時轉染質粒。每個孔都轉染PRDX1質粒3 μg，第1個孔未轉染UCH37質粒，第2、3、4個孔分別轉染UCH37質粒2 μg、4 μg和8 μg。轉染48 h后收集細胞，用試劑盒分離細胞質和細胞核蛋白分別行Western blotting檢測(圖3B)。結果顯示，c-Myc主要在細胞核中，細胞質中基本沒有表達。此外，隨著UCH37的梯度表達增高，細胞核內c-Myc蛋白表達量逐漸增高。

3 討論

依賴泛素的蛋白質降解途徑(UPP)可選擇性地降解細胞內的蛋白質，是一條重要的非溶酶體蛋白降解途徑，對蛋白質翻譯后修飾和降解起著關鍵作用[7-9]。UCH37是一種去泛素化酶。目前關于UCH37發揮去泛素化酶作用的機制研究得較為深入，即UCH37和26S蛋白酶體的一個亞基hRpn13通過C末端共同的KEKE模序，將UCH37富集到26S蛋白酶體的表面，解除UCH37自主抑制作用，從而激活其去泛素化酶的活性[10]。然而，關于UCH37在信號轉導、作用的底物蛋白、細胞功能等方面的研究較少。有文獻報道，UCH37可上調轉化生長因子-β(TGF-β)通路[11]；可能通過與人Ino80染色質重塑復合物(hINO80)結合發揮調控基因轉錄的作用[12]；通過Wnt通路參與腫瘤的發生、發展[13]。UCH37在腫瘤中的作用研究甚少。

圖3 c-Myc的表達情況 A PRDX1與c-Myc的激光共聚焦結果 ×400 B UCH37梯度表達增高后c-Myc表達變化

本課題組前期開展了UCH37與肝癌之間關系的研究，發現UCH37在肝癌組織中呈高表達，并且是肝癌術后無瘤生存的獨立危險因素；體外實驗結果顯示，UCH37可促進肝癌細胞的遷移和侵襲[3]。此外，應用免疫共沉淀技術，在肝癌組織中分離和富集了與UCH37相互作用的蛋白質；對免疫共沉淀產物進行雙向電泳，聯合質譜技術及高效的數據庫搜索手段，篩選出27種與UCH37相互作用的蛋白質。同時應用原核細胞表達、純化蛋白的技術，在體外得到了純化的GST-UCH37融合蛋白，將此融合蛋白與Huh7細胞總蛋白進行GST pull-down實驗，對沉淀產物行SDS-PAGE電泳，聯合質譜技術及高效的數據庫搜索手段，篩選出63種與UCH37相互作用的蛋白質。分析兩組結果，發現了一種共同的蛋白質PRDX1。

PRDX1是過氧化物酶家族成員，主要分布在細胞質，具有清除體內生物活性氧[14]、調節信號轉導通路[15-16]和分子伴侶[17]等功能。有研究顯示，PRDX1在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌、肝癌等組織中均呈高表達[18-23]，與預后不良相關[24-27]；PRDX1基因敲除能增強化學治療藥物的效果[28]。然而，另有研究顯示PRDX1是一種抑癌因子，在腫瘤組織中呈低表達，可抑制腫瘤的復發、轉移[29-30]。

鑒于PRDX1在肝癌中發揮促癌還是抑癌作用尚未明確，本課題組就PRDX1在肝癌組織中的表達情況及其對肝癌細胞生物學行為的影響進行了研究，結果發現PRDX1在肝癌組織中呈低表達，且是肝癌術后無瘤生存和總體生存的獨立危險因素；體外實驗結果顯示，PRDX1可抑制肝癌細胞的遷移和侵襲[4]。

文獻報道，PRDX1通過結合癌蛋白c-Myc的MB Ⅱ結構域，特異性抑制c-Myc的轉錄活性，調節c-Myc靶基因的表達，從而發揮其抑癌基因的特性[5-6]。c-Myc屬于Myc蛋白家族成員，是一種轉錄調控蛋白。正常細胞不表達或低表達c-Myc，惡性腫瘤細胞中c-Myc呈異常高表達，包括乳腺癌、結腸癌、宮頸癌、髓性白血病、黑色素瘤、骨肉瘤、惡性膠質瘤、小細胞肺癌及成神經管細胞瘤[31-33]。近年來有研究表明，c-Myc在肝癌組織中同樣發揮促腫瘤發生、發展的作用，并開始探索針對Myc的靶向治療藥物[34]。對其進一步的分子機制研究顯示，c-Myc具有促進腫瘤細胞增殖、抑制干細胞分化、促進腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞轉移、干擾腫瘤細胞凋亡的作用。在細胞內，c-Myc通過促進或抑制靶基因的轉錄而發揮作用：一方面，c-Myc通過促進CDC25A、周期素依賴性蛋白激酶4(CDK4)、細胞周期蛋白D2(Cyclin D2)、Cyclin E、Cyclin A等細胞周期相關生長因子的表達，促進細胞增殖及惡性轉化；另一方面，c-Myc通過抑制特異性生長阻滯基因1(GAS1)、p15、p21、p27、生長阻滯及DNA損壞基因(GADD)等生長抑制基因，解除生長抑制基因對細胞無限生長的抑制，進而促進細胞增殖及惡性轉化[35-40]。此外，c-Myc能夠調控miRNA，也受miRNA調控[41]。有研究發現，c-Myc通過泛素/蛋白酶體通路進行降解[42]。基于上述研究成果和本課題組前期的研究基礎，我們提出假設并驗證，即UCH37高表達后通過與PRDX1結合，使PRDX1與c-Myc結合減少，釋放出c-Myc聚集在細胞核內，發揮促進腫瘤進展的作用。

本實驗發現UCH37高表達后通過以下兩個方面發揮促進肝癌發生、發展的作用(圖4)：首先，UCH37高表達后對PRDX1泛素化降解增加而使其呈低表達，而在本課題組的前期研究中發現PRDX1在肝癌中是一個抑癌因子，發揮著抑制肝癌細胞遷移和侵襲的作用；其次，隨著UCH37的梯度表達增高，用相同量的PRDX1進行免疫共沉淀后，與PRDX1結合的c-Myc蛋白逐漸減少，同時細胞核內c-Myc蛋白逐漸增多，表明釋放出的c-Myc聚積在細胞核中，發揮其促進腫瘤進展的作用。因此，UCH37高表達后通過降低抑癌因子PRDX1的表達和增高促癌因子c-Myc的表達，從而發揮促進肝癌發生、發展的作用。在既往研究中，本課題組在肝癌細胞系Huh7細胞中構建UCH37與PRDX1過表達和下調的穩定的單克隆細胞株，從中探索UCH37、PRDX1與肝癌發生、發展之間的關系[3-4]，由于本研究只是初步探索UCH37通過PRDX1促進肝癌發生、發展的分子機制，只在293T細胞中進行了研究，今后將拓展至肝癌細胞系中進行深入研究。

圖4 UCH37通過PRDX1影響c-Myc表達的作用機制

綜上所述，本研究顯示，UCH37高表達后對PRDX1泛素化降解增加而使其呈低表達，同時UCH37通過與PRDX1結合使PRDX1與c-Myc結合減少，釋放出c-Myc聚集在細胞核內，從而發揮促進肝癌進展的作用。此研究結論為肝癌發生、發展的機制研究提供了新的思路。