長鏈非編碼RNA MEG3對老年乙型肝炎并發(fā)肝硬化和肝纖維化的診斷價(jià)值

趙紅英 王文浩 孫寧寧

肝纖維化是由多種病因?qū)е碌囊环N復(fù)雜的病理生理過程，是慢性肝病共同的病理特征。目前對于肝纖維化尚無特效治療方案，常難以治愈，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化。肝纖維化的病理特征為細(xì)胞外基質(zhì)在竇周間隙沉積，而細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡是導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝纖維化的主要原因[1]。目前主要采用組織病理學(xué)、影像學(xué)及分子標(biāo)志物檢查診斷肝纖維化，其中組織病理學(xué)為診斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但其屬于創(chuàng)傷性檢查，患者接受度較低；影像學(xué)檢查雖具有簡便、快捷的優(yōu)勢，但臨床缺乏特異性，無法進(jìn)行早期診斷。目前已有一些生物標(biāo)志物可用于診斷乙型肝炎肝硬化或肝纖維化，如金屬基質(zhì)蛋白酶、Ⅳ型膠原等，但它們的敏感度和特異度較低[2-3]。因此，尋找新的具有高敏感度、高特異度的生物標(biāo)志物對于早期診斷乙型肝炎肝硬化和纖維化具有重要的臨床價(jià)值。lncRNA是一種長鏈非編碼RNA，與人類的多種疾病有關(guān)，比如lncRNA母源性印記基因3(lncRNA MEG3)可抑制心臟纖維化[4]。研究表明，lncRNA MEG3通過SMO蛋白和miR-212途徑抑制肝星狀細(xì)胞的活化，可作為肝纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中重要的生物標(biāo)志物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在乙型肝炎合并肝纖維化的患者中，血清lncRNA MEG3水平低于健康對照組，其與肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān)[6]。提示lncRNA MEG3是乙型肝炎肝纖維化的重要生物標(biāo)志物。本研究通過分析乙型肝炎并發(fā)肝硬化和肝纖維化患者中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)水平，以期明確lncRNA MEG3對乙型肝炎并發(fā)肝硬化和肝纖維化的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年9月至2019年11月在滄州市中心醫(yī)院就診的60例老年乙型肝炎并發(fā)肝硬化和肝纖維化患者，其中男性35例，女性25例，年齡60～75歲，平均年齡為(66.52±5.41)歲，平均BMI為(21.32±6.46)kg/m2；其中肝硬化患者30例，肝纖維化患者30例，分別設(shè)為肝硬化組和肝纖維化組。肝硬化組中男性19例，女性11例，年齡60～75歲，平均年齡為(66.31±5.70)歲，平均BMI為(21.54±6.84)kg/m2；肝纖維化組中男性16例，女性14例，年齡60～75歲，平均年齡為(66.89±5.53)歲，平均BMI為(21.20±6.33)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥60歲；(2)患者均符合《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(2015年版)》[7]中乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)簽署知情同意書；(4)無其他重大疾病，能夠配合此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1個(gè)月內(nèi)接受過抗病毒藥物的治療；(2)具有器質(zhì)性病變者；(3)伴有精神疾病或認(rèn)知障礙者；(4)合并有器官衰竭、惡性腫瘤者；(5)臨床資料缺失者。另選擇同期在本院進(jìn)行手術(shù)治療的30例老年肝血管瘤患者作為對照組，其中男性16例，女性14例，年齡60～75歲，平均年齡為(66.78±5.23)歲，平均BMI為(22.04±5.28)kg/m2。肝硬化組、肝纖維化組和對照組在年齡、性別、BMI方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)滄州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號2017018)。

1.2 研究方法

1.2.1 Ishak肝臟病變嚴(yán)重程度評分 肝纖維化和肝硬化患者進(jìn)行超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺或組織學(xué)檢查，對照組患者術(shù)中獲取肝組織，使用4%甲醛固定所取得的肝組織。取部分組織進(jìn)行石蠟包埋，5 μm厚度切片，然后行H-E染色。采用Ishak評分系統(tǒng)評估肝臟疾病分期，Ishak評分≥3分提示肝纖維化，Ishak評分≥5分提示肝硬化。

1.2.2 lncRNA MEG3表達(dá)水平檢測 取少量受試者的肝組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR)法檢測肝組織lncRNA MEG3的表達(dá)水平。參照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，應(yīng)用BIO-RAD反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后25 ℃ 5 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶活性，使用去離子水將cDNA稀釋10倍后置于-20 ℃保存。進(jìn)行real-time qPCR操作，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，之后94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、74 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算lncRNA MEG3的相對表達(dá)量[5]。引物由上海瀚杭生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 從液氮罐中取出肝組織凍存管，解凍后按照實(shí)驗(yàn)室方法培養(yǎng)，加入蛋白裂解液，提取總蛋白。使用BCA蛋白試劑盒測定細(xì)胞中總蛋白含量，以GAPDH為內(nèi)參，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測肝組織中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)的表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Tanon 1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化組和肝硬化組Ishak評分比較

肝纖維化組Ishak評分為(4.02±0.95)分，低于肝硬化組[(7.31±2.20)分]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.520，P<0.001)。

2.2 各組肝組織中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平比較

對照組、肝纖維化組、肝硬化組lncRNA MEG3的表達(dá)水平中位數(shù)分別為17.96(11.84，20.50)、10.38(7.36，12.88)、5.27(4.18，6.68)。與對照組比較，肝纖維化組、肝硬化組lncRNA MEG3表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；與肝纖維化組比較，肝硬化組lncRNA MEG3表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05；與肝纖維化組比較，#P<0.05

2.3 各組肝組織中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平比較

與對照組比較，肝纖維化組、肝硬化組β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；肝纖維化組與肝硬化組β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2。

表2 各組肝組織中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平比較

圖2 各組肝組織中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平

2.4 相關(guān)性分析

老年乙型肝炎患者肝組織中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平與Ishak評分呈負(fù)相關(guān)，即lncRNA MEG3表達(dá)水平越低，肝臟組織病變可能越嚴(yán)重。見表3。

表3 lncRNA MEG3、β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達(dá)與Ishak評分相關(guān)性

2.5 lncRNA MEG3對肝纖維化和肝硬化的診斷價(jià)值

lncRNA MEG3診斷肝纖維化的ROC曲線下面積(AUC)為0.930，最佳截?cái)嘀禐?3.12，敏感度為86.7%，特異度為93.3%(見圖3A)。lncRNA MEG3診斷肝硬化的ROC AUC為0.926，最佳截?cái)嘀禐?.32，敏感度為96.3%、特異度為76.8%(見圖3B)。

圖3 lncRNA MEG3診斷肝纖維化和肝硬化的ROC曲線 A 肝纖維化 B 肝硬化

3 討論

乙型肝炎是一種危害性較大的傳染性疾病，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約20億人感染HBV，其中約4億人屬于慢性HBV感染者，約占總數(shù)的6%[8]。乙型肝炎患者若不及時(shí)進(jìn)行積極治療，可逐漸發(fā)展為肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌[9]。機(jī)體感染HBV后，病毒在體內(nèi)不斷復(fù)制，啟動(dòng)自身免疫應(yīng)答系統(tǒng)清除病毒時(shí)，亦可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，且可能進(jìn)一步導(dǎo)致肝纖維化。肝活組織檢查是診斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)，但此種診斷方式為有創(chuàng)性檢查，且價(jià)格昂貴，患者不易接受[10]。因此，探尋敏感度和特異度均較高的檢查方式具有重要的臨床意義。

lncRNA作為非編碼RNA的重要組成部分，可參與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及侵襲等多種生物學(xué)行為。王冰等[11]研究顯示，lncRNA MEG3可通過靶向Rac1信號通路，在宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移過程中發(fā)揮抑制作用。研究表明，有多個(gè)lncRNA分子被證實(shí)可通過多種方式參與肝硬化的形成過程[12]。lncRNA MEG3首次被發(fā)現(xiàn)于小鼠大腦中，其表達(dá)水平降低與肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)[13]。Yu等[5]研究報(bào)道，慢性乙型肝炎合并肝纖維化患者中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)水平明顯低于健康對照組。本研究檢測了乙型肝炎并發(fā)肝纖維化和肝硬化患者肝組織中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)水平，并與對照組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組lncRNA MEG3的表達(dá)水平最高，其次為肝纖維化組，而肝硬化組最低，與Yu等[5]的研究結(jié)論相符，提示肝組織中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平降低可能與老年乙型肝炎患者并發(fā)肝纖維化和肝硬化有一定關(guān)聯(lián)。

Caspase-3與細(xì)胞增殖及凋亡具有密切的聯(lián)系，其屬于Caspase家族，是一種效應(yīng)蛋白，研究顯示多種信號通路凋亡期間可能激活Caspase-3，從而促使肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎肝硬化和肝纖維患者肝組織中β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平均較對照組升高，提示肝組織β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3表達(dá)水平升高參與了老年乙型肝炎患者肝纖維化和肝硬化的發(fā)生。Pearson檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，老年乙型肝炎患者肝組織中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平與Ishak評分呈負(fù)相關(guān)，提示老年乙型肝炎患者lncRNA MEG3表達(dá)水平越低，肝臟組織病變可能越嚴(yán)重。β-catenin、Cyclin D1、Cleaved Caspase-3與Ishak評分無明顯相關(guān)性，此結(jié)果需增加樣本量進(jìn)一步分析。此外，ROC曲線分析顯示，lncRNA MEG3可作為診斷老年乙型肝炎患者肝纖維化和肝硬化的指標(biāo)，且診斷肝纖維化的特異度較高，診斷肝硬化的敏感度相對較高，具有一定推廣價(jià)值。

綜上所述，lncRNA MEG3在老年乙型肝炎并發(fā)肝硬化和肝纖維化患者中的表達(dá)水平較高，可作為此類患者的早期血清生物標(biāo)志物，在診斷乙型肝炎并發(fā)肝硬化和肝纖維等方面具有重要價(jià)值，并可用于評估患者的病情嚴(yán)重程度，值得在臨床推廣應(yīng)用。