肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血患者外周血單個核細胞中TMEM16A的表達水平及意義

李龍輝 王 宇 高文廣 趙艷紅 高 明

肝硬化食管胃底靜脈曲張破裂出血(EGVB)的病情兇險，常危及患者生命[1]。研究表明，首次出血的患者在6周內的死亡率為15%～20%，經治療6周后仍有約20%患者再出血，嚴重影響患者預后[2]。若能預判EGVB或再出血情況，可有效改善患者預后。然而，目前尚缺乏有效預判EGVB患者再出血的指標。

跨膜蛋白16A(TMEM16A)是一種鈣激活氯通道蛋白，可參與機體的多種病理生理活動，如惡性腫瘤、腺體分泌及高血壓等[3]。研究顯示，TMEM16A可誘導高血壓大鼠模型血管內皮功能障礙，從而升高血壓[4]。另有研究顯示，TMEM16A可調節門靜脈高壓大鼠模型門靜脈平滑肌細胞增殖[5]。基于此，推測TMEM16A可能通過調節門靜脈平滑肌細胞，參與了EGVB及再出血過程。目前關于TMEM16A與EGVB患者再出血的報道較少，本文對此展開研究，以期為EGVB的預防及治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年2月至2019年12月在廊坊市第四人民醫院就診的206例EGVB患者作為研究對象。納入標準：(1)經B超或CT等影像學檢查確診為肝硬化；(2)經胃鏡檢查確診為食管胃底靜脈曲張；(3)出現黑便或嘔血等癥狀；(4)簽署了知情同意書。排除標準：(1)非肝硬化導致的消化道出血；(2)合并尿毒癥及血液系統疾病等；(3)合并惡性腫瘤；(4)門脈高壓性胃腸病；(5)先天膽道阻塞性擴張；(6)不能配合完成研究所需檢查或隨訪失聯。206例EGVB患者中男性109例，女性97例，年齡24～76歲，平均年齡為(56.82±9.78)歲。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 基本信息收集

收集患者的年齡、性別、肝硬化類型、Child-Pugh分級、白蛋白、凝血酶原時間、國際標準化比值、MELD評分、白細胞計數、血紅蛋白、血鈉及治療方式等信息。采用電話隨訪及復診等方式了解入選患者24個月內有無再出血發生及預后生存狀況，每3個月隨訪1次，以2020年4月3日或該時間點前患者死亡作為隨訪終點。本研究將發生再出血及死亡定義為預后不良[1]。

1.3 單個核細胞中TMEM16A表達水平檢測

采用密度梯度離心法獲取外周血中單個核細胞[6]。抽取EGVB患者入院24 h內空腹外周靜脈血10 mL，置于Ficoll分離液中，提取單個核細胞。采用蛋白質印跡法檢測單個核細胞中TMEM16A的表達水平[7]。將RIPA裂解液滴至盛有單個核細胞的試管中提取總蛋白，然后滴加勻漿緩沖液，4 ℃環境下以3 500 r/min離心15 min，取離心后上清液。10% SDS-PAGE分離膠電泳(120 V，100 min)，轉膜緩沖液平衡，轉膜(300 mA，60 min)，然后使用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h。滴加一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；滴加二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，曝光顯影。應用ImageJ軟件進行光密度分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 預后良好組與預后不良組的基本資料比較

206例EGVB患者中97例(47.09%)預后不良，其中72例(34.95%)再出血，25例(12.14%)死亡。根據患者的預后情況將其分為預后良好組(n=109)和預后不良組(n=97)。兩組在年齡、性別、肝硬化類型、凝血酶原時間、國際標準化比值和治療方式方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)。預后良好組Child-Pugh分級B級占比，以及白蛋白、血紅蛋白和血鈉水平高于預后不良組，MELD評分和白細胞計數低于預后不良組，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組基本資料比較

2.2 兩組TMEM16A表達水平比較

預后良好組TMEM16A表達水平為0.62±0.06，高于預后不良組(0.54±0.04)，差異有統計學意義(t=11.518，P<0.001)，見圖1。

圖1 預后良好組和預后不良組的TMEM16A表達

2.3 影響EGVB患者預后的因素

將EGVB患者預后作為因變量，將Child-Pugh分級、白蛋白、MELD評分、白細胞計數、血紅蛋白、血鈉和TMEM16A作為自變量納入logistic回歸模型，結果顯示Child-Pugh分級、MELD評分和白細胞計數是EGVB患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，白蛋白、血鈉和TMEM16A是獨立保護因素(P<0.05)，見表2。

2.4 TMEM16A與EGVB患者預后的關系

采用限制性立方樣條擬合logistic回歸分析TMEM16A與EGVB患者預后的關系。通過比較不同節點個數所對應的AIC值，最終確定節點個數為5時AIC值最小(AIC=176.356)。分析結果表明TMEM16A與EGVB患者預后有關(χ2=46.50，P<0.001)，且呈非線性關系(非線性檢驗χ2=12.67，P=0.005)。TMEM16A診斷EGVB患者預后的最佳截斷值為0.57，與TMEM16A=0.57比較，當TMEM16A<0.57時，預后不良風險較高；當TMEM16A>0.57時，預后不良風險較低，見圖2。

表2 影響EGVB患者預后的logistic回歸分析

圖2 TMEM16A與EGVB患者預后的限制性立方樣條圖

3 討論

EGVB是肝硬化失代償期的嚴重并發癥之一，發病率和病死率均較高，預后不良風險較高[8-10]。EGVB主要病因是肝硬化誘發的門靜脈壓升高[11]。既往研究表明，血管內皮功能紊亂和平滑肌細胞異常增殖與高血壓關系密切[12-13]。Ma等[4]研究表明TMEM16A可通過調節血管內皮功能降低大鼠血壓。Zeng 等[5]研究指出，TMEM16A在膽管結扎誘導的門靜脈高壓大鼠模型中表達下調，且其表達下調會促進血管平滑肌細胞增殖。由此推測，TMEM16A可通過調節血管內皮功能及血管平滑肌細胞增殖參與EGVB的發生過程，檢測其水平或可評估患者預后。本研究通過比較兩組外周血單個核細胞中TMEM16A的表達水平，結果發現預后良好組TMEM16A的表達水平高于預后不良組。

既往研究表明，EGVB患者的預后不良發生率約為40%[14-15]，本研究中EGVB患者的預后不良發生率(47.09%)與既往研究結果相近。張莉等[2]研究表明，Child-Pugh分級、MELD評分和白細胞計數是EGVB短期預后的危險因素，而白蛋白、血鈉是EGVB短期預后的保護因素。本研究通過多因素logistic回歸分析影響EGVB患者預后的因素，結果顯示Child-Pugh分級、MELD評分和白細胞計數是EGVB患者預后的獨立危險因素，而白蛋白、血鈉是EGVB患者預后的獨立保護因素，與上述研究結果一致。此外，本研究結果還顯示，TMEM16A是EGVB患者預后的獨立保護因素。本研究采用限制性立方樣條分析TMEM16A與EGVB患者預后的關系，結果發現與TMEM16A=0.57比較，當TMEM16A<0.57時，預后不良風險較高；當TMEM16A>0.57時，預后不良風險較低。提示低TMEM16A水平可反映血管平滑肌細胞異常增殖及血管內皮功能紊亂，致使門靜脈壓升高，最終導致食管胃底靜脈曲張破裂出血。

本研究存在一些不足之處，如單中心研究、樣本例數偏少、隨訪時間較短等，且僅分析了TMEM16A與EGVB短期內再出血的關系，下一步將針對以上不足開展多中心、大樣本研究，并延長隨訪時間，以驗證本研究的結論。綜上所述，EGVB患者外周血單個核細胞中TMEM16A的表達水平低提示其預后不良風險較高，檢測其水平有助于評估患者預后。