慢性乙型肝炎肝纖維化患者外周血單個核細胞中TET3水平與纖維化程度的關系

安紅杰 耿 華 葛志勝 徐金鳳 何文艷 趙崇山 高美麗 陳俊紅

慢性乙型肝炎(CHB)患者隨病程進展多伴有肝纖維化[1]。肝纖維化是CHB病程進展的重要病理過程，若不及時進行干預，易發展為肝硬化，甚至肝細胞癌[2]。中國每年約有60萬人因CHB肝硬化及肝細胞癌死亡[3]。探究肝纖維化的發病及進展機制對于抑制肝纖維化進展尤為重要。已有多項研究表明肝纖維化與肝星狀細胞激活有關[4-6]。HBV誘發肝損傷可激活肝星狀細胞，增加細胞外基質分泌，還可誘使活化的肝星狀細胞轉化為成纖維細胞，導致肝纖維化發生及進展。早期了解肝纖維化程度并及時進行干預可有效抑制肝纖維化進展[7-9]。目前，肝穿刺活組織檢查是確診肝纖維化程度的金標準[10]，但由于其為有創傷性檢查，且檢查耗時較長，不利于臨床廣泛應用。因此，需探究便利、準確的生物標志物或檢查手段以評估肝纖維化程度。

10-11轉位酶3(TET3)是一種DNA去甲基化酶，可將5-甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶[11]。有研究表明，TET3可靶向長鏈非編碼RNA HIF1A-AS1介導肝星狀細胞活化[12]；此外，TET3/轉化生長因子-β1(TGF-β1)的正反饋回路可促進肝纖維化進展[13]。由此推測TET3參與了肝纖維化的進展過程，其表達水平與肝纖維化程度有關。外周血單個核細胞可反映肝纖維化程度，且在外周血中含量較高，易于采集[14]。本文探究了CHB肝纖維化患者外周血單個核細胞中TET3水平與肝纖維化程度的關系，以期為評估肝纖維化程度提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年9月至2019年12月在河北中石油中心醫院確診的137例CHB肝纖維化患者作為研究對象。根據《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[14]診斷CHB。納入標準：(1)接受肝穿刺活組織病理檢查，并診斷為肝纖維化；(2)未接受抗病毒和抗纖維化治療；(3)能夠配合完成相關檢查；(4)簽署了知情同意書。排除標準：(1)合并自身免疫性肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎或非酒精性脂肪性肝病等；(2)合并肝細胞癌；(3)除HBV感染之外，合并其他嚴重感染性疾病。137例CHB肝纖維化患者中男性85例，女性52例，年齡20～66歲，平均年齡為(45.78±11.02)歲；其中S1期28例，S2期36例，S3期30例，S4期43例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準(批件號KYLL-2019-06)。

1.2 臨床信息收集及處理

收集年齡、性別等信息，使用7600型全自動生化分析儀(日本日立公司)檢測肝穿刺活組織檢查前1日或當日AST和ALT水平，使用DxH 600血細胞分析儀[貝克曼庫爾特實驗系統(蘇州)有限公司]檢測血小板(PLT)水平。計算AST/PLT比值指數(APRI)和肝纖維化指數(FIB-4)，APRI=AST(/正常值上限，U/L)/PLT(×109/L)×100，FIB-4=年齡×AST(U/L)/[PLT(×109/L)×ALT(U/L)1/2]。

1.3 肝纖維化程度判斷

超聲引導下將活組織穿刺針插入CHB肝纖維化患者肝部，取出約2 cm的肝組織，由本院病理科2名副主任醫師評估肝纖維化程度。肝纖維化程度分為S1期、S2期、S3期和S4期。S1期 匯管區肝纖維化擴大，局限竇周或肝小葉內纖維化；S2期 肝匯管區周圍纖維化，纖維間隔形成，但肝小葉結構保留；S3期 纖維間隔及肝小葉結構紊亂，但未進展至肝硬化；S4期 肝硬化[14]。

1.4 外周血單個核細胞中TET3表達水平檢測

抽取CHB肝纖維化患者肝穿刺活組織檢查前1日或當日的空腹肘部靜脈血10 mL，采用密度梯度離心法提取外周血中單個核細胞[15]。步驟如下：25 ℃ 800 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm，取離心后下層血細胞，置入10 mL Ficoll分離液中，提取外周血單個核細胞。

采用蛋白質印跡法檢測單個核細胞中TET3的表達水平[16]。步驟如下：取上述實驗獲取的外周血單個核細胞，滴加RIPA裂解液至裝有單個核細胞的試管中，裂解細胞，獲取總蛋白，然后使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白質定量。80 V凝膠電泳15 min，然后加壓至120 V，直至溴酚藍跑出膠面，轉膜，然后用5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加兔抗人TET3單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，滴加二抗，室溫下孵育2 h。采用電化學發光法(ELC)曝光顯影。應用ImageJ 1.8.0軟件讀取蛋白質印跡實驗的條帶灰度值。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組基本資料比較

S1期、S2～S3期和S4期患者在年齡、性別方面比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)；在AST、ALT、PLT、APRI指數和FIB-4指數方面比較，3組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。S4期AST水平、APRI指數和FIB-4指數均高于S1期和S2～S3期，差異均有統計學意義(P均<0.05)。S4期ALT水平高于S1期，PLT水平低于S1期，差異均有統計學意義(P均<0.05)。S2～S3期AST、ALT和APRI指數均高于S1期，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組基本資料比較

2.2 各組TET3水平比較

S1期、S2～S3期和S4期外周血單個核細胞中TET3水平分別為2.17±0.71、3.39±1.18和5.75±1.40，3組間比較差異有統計學意義(F=89.023，P<0.001)。S4期外周血單個核細胞中TET3水平高于S1期和S2～S3期，差異均有統計學意義(P均<0.05)。S2～S3期外周血單個核細胞中TET3水平高于S1期，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 TET3水平與肝纖維化程度的關系

外周血單個核細胞中TET3水平與肝纖維化病理分期呈正相關關系(rs=0.811，P<0.001)。

圖1 TET3與肝纖維化病理分期的散點圖

2.4 TET3診斷肝纖維化程度的效能

外周血單個核細胞中TET3診斷≥S2期、≥S3期和S4期的AUC分別為0.873、0.940和0.930，均大于APRI指數和FIB-4指數的AUC，差異均有統計學意義[APRI(Z=2.037，P=0.042；Z=4.560，P<0.001；Z=3.161，P<0.001)，FIB-4(Z=3.124，P=0.002；Z=5.976，P<0.001；Z=4.670，P<0.001)]。見表2、圖2。

表2 TET3診斷肝纖維化程度的效能比較

圖2 TET3診斷肝纖維化程度的ROC曲線 A 肝纖維化程度≥S2期 B 肝纖維化程度≥S3期 C 肝纖維化程度為S4期

3 討論

研究表明，下調DJ-1蛋白表達可降低肝細胞、肝臟庫普弗細胞氧自由基水平，同時減少中性粒細胞和吞噬細胞浸潤，抑制肝纖維化進展[17]。及時了解CHB患者肝纖維化程度并進行干預，對于改善患者預后意義重大。肝臟病理學活組織檢查是評價肝纖維化程度的金標準，但由于其為有創性檢查，難以動態評估肝纖維化程度；此外，若取樣不足，無法進行評估[18]。瞬時彈性成像技術是無創性評估肝纖維化程度的方法之一，具有較高的價值[19]，但對有腹水、肥胖或肋間隙較小的患者，其評估結果的效能較低[20]；此外，該檢查費用較高，對于操作技術也有一定要求，因此臨床大規模應用受限。

TET3在人肝纖維化組織和小鼠肝纖維化組織中均高表達。TET3/TGF-β1的正反饋回路不僅可促使肝星狀細胞表達纖維化相關基因，還可誘使肝細胞大量表達TGF-β1，促進了肝纖維化的進展。有研究表明，抑制TET3表達，可改善四氯化碳誘導的肝纖維化[13]。由此推測，TET3可通過上述機制參與CHB患者肝纖維化的發生及發展過程，檢測其在外周血單個核細胞中的表達水平有望評估肝纖維化程度。

本研究比較了S1期、S2～S3期和S4期患者外周血單個核細胞中TET3的表達水平，結果顯示S4期外周血單個核細胞中TET3的表達水平高于S1期和S2～S3期，S2～S3期外周血單個核細胞中TET3的表達水平高于S1期，表明隨CHB肝纖維化程度加重，外周血單個核細胞中TET3的表達水平也隨之升高，提示外周血單個核細胞中TET3的表達水平與肝纖維化關系密切。隨后，本研究進一步分析了CHB肝纖維化患者外周血單個核細胞中TET3的表達水平與肝纖維化程度的關系，結果顯示外周血單個核細胞中TET3的表達水平與肝纖維化病理分期呈正相關，提示檢測CHB肝纖維化患者外周血單個核細胞中TET3的表達水平有助于評估肝纖維化程度。

APRI指數和FIB-4指數的計算較為簡便，相關指標的檢測費用也較為低廉，已被歐洲肝病指南推薦為評估慢性丙型肝炎肝纖維化的指標，尤其適用于醫療技術不發達的地區[21]。多項研究表明，APRI指數和FIB-4指數對于評估CHB肝纖維化程度具有較高價值[22-23]。本文構建了TET3、APRI指數和FIB-4指數診斷肝纖維化程度≥S2期、≥S3期和S4期的ROC曲線，結果顯示外周血單個核細胞中TET3診斷≥S2期、≥S3期和S4期的AUC分別為0.873、0.940和0.930，均大于APRI指數和FIB-4指數的AUC，提示外周血單個核細胞中TET3的表達水平可輔助評估CHB肝纖維化程度。

綜上所述，CHB肝纖維化患者外周血單個核細胞中TET3的表達水平與肝纖維化程度關系密切。CHB肝纖維化患者外周血單個核細胞中TET3的表達水平越高，提示肝纖維化程度越嚴重。檢測CHB患者外周血單個核細胞中TET3的表達水平可輔助評估肝纖維化程度，有利于臨床動態評估抗纖維化治療方案的療效。本研究的不足之處在于為單中心研究，納入樣本均為同一地區患者，為避免對實驗結果造成偏倚，今后還需進一步開展多中心、跨地域的深入研究。