miR-551b在潰瘍性結(jié)腸炎組織中的表達(dá)及意義

張镕宇 陳君婷 陳桂權(quán) 劉宇虎 黃妙興 陳曉春 李志堅(jiān)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因尚未完全明確的腸道炎性疾病，隨著人們生活方式及飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1-2]。UC臨床表現(xiàn)為便血、高熱及反復(fù)發(fā)作的腹痛等，且具有復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多的特點(diǎn)[3-5]。隨著UC病情進(jìn)展及反復(fù)發(fā)作，部分患者可出現(xiàn)腸道梗阻或穿孔等腸道結(jié)構(gòu)性損傷，嚴(yán)重者甚至發(fā)生癌變[6]。因此，及時(shí)評估UC患者的預(yù)后情況并制定合理的治療方案，對于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。UC疾病活動(dòng)度可在一定程度上反映患者的預(yù)后情況，但判斷UC疾病活動(dòng)度需采用腸鏡檢查。腸鏡檢查是一項(xiàng)侵入性操作，有部分人群因不能耐受或心理上難以接受而放棄檢查，且現(xiàn)有的內(nèi)鏡評價(jià)方法易受主觀因素影響，如簡化內(nèi)鏡評分及內(nèi)鏡指數(shù)等[7]。細(xì)胞試驗(yàn)表明，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的異常表達(dá)可通過損傷腸道屏障功能誘發(fā)UC的發(fā)生、發(fā)展[2]。另有研究指出，miR-551b可通過激活NF-κB的活化調(diào)節(jié)LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)，而LC3Ⅱ蛋白參與了UC的病理生理過程[8]。由此推測，miR-551b可能與UC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本文檢測了miR-551b在潰瘍性結(jié)腸炎(UC)組織中的表達(dá)水平，并探究其與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床評估UC患者的預(yù)后情況提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2015年9月至2018年9月在東莞市人民醫(yī)院接受治療的75例UC患者作為研究對象。參照《中國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見》[9]診斷UC。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合UC診斷標(biāo)準(zhǔn)：(2)入組前未接受非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑等藥物治療；(3)能夠配合完成隨訪；(4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并消化道惡性腫瘤；(2)合并全身感染性疾病；(3)合并嚴(yán)重的心、肝、腎、肺等臟器功能障礙；(4)妊娠期及哺乳期婦女。75例UC患者中男性45例，女性30例，年齡19～40歲，平均年齡為(26.99±4.03)歲；病變位于直腸32例，左半結(jié)腸22例，廣泛結(jié)腸21例。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 miR-551b表達(dá)水平檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR)法檢測UC患者miR-551b的相對表達(dá)量。無菌條件下剪碎黏膜組織，置于液氮中研磨，離心分離后取上層清液置于EP管中。應(yīng)用TRIzol試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度及物質(zhì)的量濃度。將2 μg的總RNA添加至20 μL反應(yīng)液中，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min預(yù)變性，之后95 ℃ 42 s、15 s退火、70 ℃ 42 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示miR-551b的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 UC疾病嚴(yán)重程度

按照《中國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見》[9]標(biāo)準(zhǔn)評估患者疾病嚴(yán)重程度。輕度 排便次數(shù)<4次/d，紅細(xì)胞沉降率<20 mm/h，血紅蛋白、體溫、脈搏正常；中度 排便次數(shù)4～6次/d，紅細(xì)胞沉降率20～30 mm/h，血紅蛋白41～119 g/L，體溫36.1～37.8 ℃，脈搏60～90次/min；重度 排便次數(shù)>6次/d，紅細(xì)胞沉降率>30 mm/h，血紅蛋白≤40 g/L，脈搏>90次/min，體溫>37.8℃。輕度、中度、重度劃分標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)滿足以上條件。

1.4 隨訪

采用復(fù)診方式對患者進(jìn)行隨訪，觀察患者出院后12個(gè)月內(nèi)的預(yù)后情況。本研究將復(fù)發(fā)、UC相關(guān)黏膜異常增生及癌變定義為預(yù)后不良。隨訪起始時(shí)間為2015年9月27日，截止時(shí)間為2019年10月4日，每3個(gè)月隨訪1次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 UC患者的預(yù)后情況

75例UC患者在隨訪期間的預(yù)后不良發(fā)生率為42.67%(32/75)，其中復(fù)發(fā)23例(30.67%)，UC相關(guān)黏膜異常增生9例(12.00%)。

2.2 預(yù)后不良組和預(yù)后良好組的基本資料比較

預(yù)后不良組與預(yù)后良好組在年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、家族史、病變范圍、1年內(nèi)應(yīng)用免疫抑制劑、合并原發(fā)性硬化性膽管炎、IL-6、血紅蛋白、紅細(xì)胞沉降率、血小板計(jì)數(shù)方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；預(yù)后不良組重度活動(dòng)度、初治時(shí)應(yīng)用激素類藥物、肛周病變、基底漿細(xì)胞增多、腸切除術(shù)史的占比高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。詳見表2。

2.3 兩組miR-551b相對表達(dá)量比較

預(yù)后不良組miR-551b的相對表達(dá)量為2.53±0.47，高于預(yù)后良好組(1.93±0.41)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.888，P<0.001)。

2.4 影響UC患者預(yù)后的因素

將疾病嚴(yán)重程度(輕、中度=0，重度=1)、初治時(shí)應(yīng)用激素類藥物(否=0，是=1)、肛周病變(否=0，是=1)、基底漿細(xì)胞增多(否=0，是=1)、腸切除術(shù)史(無=0，有=1)、miR-551b作為自變量，α入=0.05，α出=0.10，將UC患者預(yù)后情況(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)作為因變量納入logistic回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示疾病嚴(yán)重程度、初治時(shí)應(yīng)用激素類藥物、肛周病變、腸切除術(shù)史及miR-551b與UC患者的預(yù)后密切相關(guān)。詳見表3。

2.5 miR-551b、模型A、模型B評估UC患者預(yù)后的效能

采用多因素logistic回歸模型分析法構(gòu)建由疾病嚴(yán)重程度、初治時(shí)應(yīng)用激素類藥物、肛周病變、腸切除術(shù)史組成的預(yù)測UC患者預(yù)后的模型，公式：F=-0.666+1.163×疾病嚴(yán)重程度+0.064×初治時(shí)應(yīng)用激素類藥物+1.360×肛周病變+0.095×腸切除術(shù)史，將其命名為模型A；構(gòu)建由疾病嚴(yán)重程度、初治時(shí)應(yīng)用激素類藥物、肛周病變、腸切除術(shù)史、miR-551b組成的預(yù)測UC患者預(yù)后的模型，公式：F=-7.536+0.085×疾病嚴(yán)重程度+0.038×初治時(shí)應(yīng)用激素類藥物+0.662×肛周病變+1.027×腸切除術(shù)史+3.088×miR-551b，將其命名為模型B。miR-551b預(yù)測UC患者預(yù)后的ROC曲線下面積(AUC)與模型A比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.039，P=0.299)；模型B預(yù)測UC患者預(yù)后的ROC AUC大于模型A和miR-551b的AUC，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.268，P=0.023；Z=3.105，P=0.002)。詳見表4、圖1。

表2 兩組的基本資料比較

表3 影響UC患者預(yù)后的多因素logistic回歸分析

表4 miR-551b、模型A、模型B評估UC患者預(yù)后的效能

圖1 miR-551b、模型A、模型B評估UC患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

miRNA是一種在進(jìn)化上趨于保守的內(nèi)源性非編碼RNA，已有研究表明多種miRNA可參與UC的病理生理過程[10-12]，如有報(bào)道指出，miR-551b在UC患者中異常表達(dá)[13]，然而目前關(guān)于miR-551b與UC患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少。

本研究結(jié)果顯示，預(yù)后不良組患者miR-551b的相對表達(dá)量高于預(yù)后良好組，提示miR-551b可能與UC患者的預(yù)后存在聯(lián)系。本文采用多因素logistic回歸方法分析影響UC患者預(yù)后的因素，結(jié)果顯示疾病嚴(yán)重程度、初治時(shí)應(yīng)用激素類藥物、肛周病變、腸切除術(shù)史與UC患者的預(yù)后密切相關(guān)，與既往報(bào)道相符[14-15]；同時(shí)，本研究結(jié)果表明，miR-551b與UC患者的預(yù)后密切相關(guān)。

研究表明，miR-551可通過促進(jìn)NF-κB的表達(dá)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)水平[8]，而LC3Ⅱ的異常表達(dá)可參與UC的發(fā)生、發(fā)展過程[2]。LC3Ⅱ蛋白定位于自噬泡內(nèi)膜，LC3前體激活后形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ暴露的甘氨酸殘基可與自噬泡內(nèi)膜磷脂酰乙醇胺結(jié)合成為LC3Ⅱ[16]。LC3Ⅱ蛋白是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)，其在腸道胞內(nèi)菌的清除過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。LC3Ⅱ缺陷將導(dǎo)致持續(xù)性胞內(nèi)菌感染，引起Paneth細(xì)胞形態(tài)學(xué)異常和分泌功能改變，誘發(fā)持續(xù)性腸道炎性反應(yīng)[18]。此外，有細(xì)胞試驗(yàn)表明，TNF-α與自噬抑制劑可協(xié)同作用于腸道上皮細(xì)胞，抑制LC3Ⅱ蛋白表達(dá)，使細(xì)胞黏附能力下降，損傷腸道上皮屏障功能，導(dǎo)致UC發(fā)生[19]。由此推測，miR-551b可通過調(diào)節(jié)LC3Ⅱ的表達(dá)參與UC的疾病進(jìn)展。

本研究構(gòu)建了miR-551b、模型A及模型B評估UC患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示模型B評估UC患者預(yù)后的效能高于miR-551b及模型A，提示聯(lián)合miR-551b更有利于評估UC患者的預(yù)后情況。

綜上所述，miR-551b與UC患者的預(yù)后關(guān)系密切，檢測miR-551b的表達(dá)水平有助于評估UC患者的預(yù)后情況。本課題組下一步將動(dòng)態(tài)監(jiān)測miR-551b的表達(dá)水平，并進(jìn)行基礎(chǔ)研究，進(jìn)一步分析miR-551b影響UC患者預(yù)后的病理生理學(xué)機(jī)制。