過表達miR-182-5p對克羅恩病大鼠的保護作用及機制研究

婁海芳 胡 娟 吳海翔

克羅恩病(CD)是一種慢性腸道非特異性炎性疾病，具有病情反復、并發癥多等特點[1]。若不及時控制CD患者病情，易并發腸瘺、腸穿孔及腸梗阻等，嚴重影響患者預后[2]。研究顯示，37%～61%的CD患者在確診10年內接受至少1次手術治療[3]。目前，關于CD的發病機制尚未完全闡明，多數學者認為其發病與遺傳、免疫功能紊亂等有關，尚缺少有效的治療藥物[4]。因此，探究CD的發病機制對于其治療方案的選擇及靶向藥物研發均具有重要意義。

miRNA是一種由18～24個核苷酸組成的不具備編碼蛋白質功能的單鏈RNA，可參與CD的發病及進展過程。Yan等[5]研究表明，miR-21在CD患者中特異性表達，且與CD疾病活動指數(CDAI)呈正相關。另有研究表明，miR-200和miR-125a也參與了CD的發病和進展過程[6-7]。有報道指出，miR-182-5p可通過調控Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB信號轉導通路抑制炎性反應[8]；而TLR4/NF-κB信號轉導通路與CD有關[9-11]，推測miR-182-5p與CD存在聯系。本文探究了miR-182-5p的表達對克羅恩病(CD)大鼠的作用及機制，以期闡明miR-182-5p與CD的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究選取36只SPF級的SD大鼠，均購自于南京拉姆達醫藥有限公司，實驗動物許可證號：SYXK(蘇)2017-0040。大鼠均適應性飼養1周，期間自由攝水、攝食，控制飼養溫度為25 ℃，濕度為60%，晝夜交替周期為12 h。

1.2 方法

1.2.1 CD大鼠模型構建 從36只SD大鼠中隨機選取8只作為正常組，不予任何處理，其余28只給予TNBS/50%乙醇溶液灌腸處理(給藥劑量為150 mg/kg)構建CD大鼠模型[12]。造模21 d后，隨機選取4只大鼠行H-E染色，驗證是否造模成功。將造模成功的24只大鼠隨機分為3組：模型組、對照組和過表達組，每組各8只。對照組給予尾靜脈注射5 μL含空載質粒的慢病毒；過表達組給予尾靜脈注射5 μL含過表達miR-182-5p質粒的慢病毒，每周注射1次，共注射2次。采用實時熒光定量PCR法檢驗miR-182-5p過表達是否成功。

1.2.2 CDAI評分 根據大鼠體質量減失率、糞便性狀、糞便隱血及血便這3個維度計算CDAI評分。體質量減失率分為0～4分：0分 體質量減失率為0；1分 體質量減失率為1%～4%；2分 體質量減失率為5%～9%；3分 體質量減失率為10%～14%；4分 體質量減失率≥15%。糞便性狀分為0～4分：0分 糞便性狀正常；1分 糞便松散；2分 糞便松散程度增加，未達到稀便；3分 稀便；4分 稀便程度增加。糞便隱血及血便分為0～4分：0分 無隱血；1分 隱血陽性；2分 隱血陽性程度增加；3分 肉眼可見血便；4分 肉眼可見血便程度增加。CDAI評分為上述3項評分之和[13]。

1.2.3 H-E染色 在末次注射1周后處死大鼠，取位于橫結腸、距肛門1 cm處的腸組織，4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片。脫蠟后滴加染料，然后乙醇脫水，封片。在光學顯微鏡下觀察結腸組織病理變化。

1.2.4 炎性因子水平檢測 采用ELISA法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平。取實驗1.2.3中大鼠心臟血液3 mL，3 000 r/min離心5 min，提取上層清液，分別置于IL-1β、IL-6和TNF-α檢測試劑盒(均購自上海碧云天生物技術有限公司)中進行反應，使用酶標儀讀取吸光度值。

1.2.5 miR-182-5p表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測miR-182-5p的表達水平[14]。取實驗1.2.3中大鼠結腸組織，研磨成組織勻漿，使用TRIzol試劑(購自日本TAKARA公司)提取組織勻漿中總RNA，使用反轉錄試劑盒(購自日本TAKARA公司)將RNA反轉錄為cDNA，使用PCR擴增儀[(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司]擴增cDNA，擴增條件為95 ℃預變性5 min，之后95 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共計35個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt表示miR-182-5p的相對表達量。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司設計，序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 TLR4和NF-κB表達水平檢測 采用蛋白質印跡法檢測結腸組織中TLR4和NF-κB的表達水平[15]。使用RIPA裂解液裂解結腸組織細胞，提取細胞總蛋白，應用BCA蛋白定量測定試劑盒進行蛋白定量；凝膠電泳，電壓由80 V增至120 V，直至溴酚藍跑出膠面，300 mA電流轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；分別滴加兔抗鼠TLR4單克隆抗體、兔抗鼠NF-κB單克隆抗體和兔抗鼠β-actin單克隆抗體(均購自臺灣亞諾法生技股份有限公司)，4 ℃孵化過夜；分別滴加山羊抗兔二抗[購自安諾倫(北京)生物科技有限公司]，室溫孵育2 h；ELC發光液顯影。應用ImageJ軟件讀取實驗圖像并進行分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組CDAI比較

正常組、模型組、對照組和過表達組的CDAI評分分別為(0.82±0.16)分、(3.57±0.25)分、(3.48±0.30)分和(2.01±0.45)分，4組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組CDAI評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組與對照組的CDAI評分差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組和對照組比較，過表達組的CDAI評分降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠結腸組織病理學變化

H-E染色結果可知，正常組結腸組織中腺管結構完整、清晰，杯狀細胞分布均勻，無炎性細胞浸潤；模型組和對照組中腺管結構模糊，黏膜層損傷嚴重，其中黏膜固有層有大量炎性細胞浸潤；過表達組中腺管結構較完整、清晰，杯狀細胞分布較均勻，有少量炎性細胞浸潤。見圖1。

2.3 各組miR-182-5p表達水平比較

正常組、模型組、對照組和過表達組的miR-182-5p的相對表達量分別為1.02±0.11、0.26±0.05、0.26±0.06和1.54±0.10，4組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組miR-182-5p的表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組與對照組的miR-182-5p表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組和對照組比較，過表達組的miR-182-5p表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 各組大鼠結腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平比較

由表2可知，與正常組比較，模型組的IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平均升高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。模型組與對照組的IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組和對照組比較，過表達組的IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平均降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。

圖1 各組結腸組織病理圖像 H-E染色 ×100 A 正常組 B 模型組 C 對照組 D 過表達組

表2 各組大鼠結腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平比較/ng·L-1

2.5 各組大鼠結腸組織TLR4和NF-κB表達水平比較

由表3、圖2可知，與正常組比較，模型組的TLR4和NF-κB表達水平均升高，差異均有統計學意義(P均<0.05)。模型組與對照組的TLR4和NF-κB表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組和對照組比較，過表達組的TLR4和NF-κB表達水平均降低，差異均有統計學意義(P均<0.05)。

表3 各組大鼠結腸組織中TLR4和NF-κB的相對表達量比較

圖2 各組大鼠結腸組織中TLR4和NF-κB的表達 A 正常組 B 模型組 C 對照組 D 過表達組

3 討論

CD患者主要的臨床表現為腹痛、腹瀉、腹部包塊及膿血樣便等，其病理學變化主要為結腸組織炎性反應[16]。本實驗采用TNBS/50%乙醇溶液灌腸構建CD大鼠模型，經H-E染色觀察顯示，大鼠結腸組織腺管結構模糊，黏膜層損傷嚴重，其中黏膜固有層有大量炎性細胞浸潤，表明CD大鼠模型造模成功。此外，經實時熒光定量PCR法檢測miR-182-5p表達水平，結果顯示過表達組miR-182-5p表達水平顯著高于對照組，表明過表達miR-182-5p模型構建成功。

CDAI評分可較為客觀地反映結腸損傷情況。本研究結果顯示，過表達組的CDAI評分低于對照組，表明過表達miR-182-5p可減輕TNBS誘導的CD大鼠癥狀；此外，H-E染色結果也表明過表達組結腸組織的損傷程度輕于對照組，提示過表達miR-182-5p對CD大鼠有一定保護性作用。

IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平與炎性反應關系密切，已被用于評價機體炎性反應狀態。本研究結果顯示，過表達組的IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平均低于對照組，表明過表達miR-182-5p可降低CD大鼠結腸組織中炎性因子的表達水平。研究表明，TLR4/NF-κB信號轉導通路可參與IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子的調節，與炎性疾病的關系密切[17]；此外，TLR4還可調節腸道黏膜的先天防御系統，可保護腸道黏膜，維持腸道微生態平衡[18]。另有多項研究表明，TLR4/NF-κB信號轉導通路在CD中發揮著重要作用，可通過促進炎性細胞因子分泌而加重結腸組織炎性損傷[19-20]。本研究結果顯示，過表達組的TLR4和NF-κB表達水平均低于對照組，表明過表達miR-182-5p可抑制CD大鼠結腸組織中TLR4和NF-κB的表達，進而發揮其保護CD大鼠的作用。

綜上所述，過表達miR-182-5p對TNBS誘導的CD大鼠具有一定的保護性作用，可降低炎性因子表達水平，其機制可能與調控TLR4/NF-κB信號轉導通路有關。本研究僅探究了過表達miR-182-5p對TLR4/NF-κB信號轉導通路的影響，下一步將驗證其是否可通過調節其他信號轉導通路參與CD的發病及進展。