不同產(chǎn)地水冬瓜葉HPLC指紋圖譜建立、化學(xué)模式識別分析及含量測定

韓忠耀 向軍 陳建宇 宋義勇 李仕外 唐文雙 葉祖軍 張林甦 田浩 王萬樂

中圖分類號 R284.1 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）10-1224-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.11

摘 要 目的：為水冬瓜葉藥材的質(zhì)量控制提供參考。方法：采用高效液相色譜法（HPLC），以Agela Promosil C18為色譜柱，以0.2%磷酸水溶液-乙腈（梯度洗脫）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）》建立10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉的HPLC指紋圖譜并進行相似度評價，通過與對照品色譜圖比對進行色譜峰的指認(rèn)。采用聚類分析、主成分分析（PCA）法和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）法進行化學(xué)模式識別分析，并篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物。采用相同HPLC法對水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷的含量進行測定。結(jié)果：10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉HPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.923～0.983。共確定了11個共有色譜峰，并指認(rèn)出了峰4、5分別為金絲桃苷、異槲皮苷。聚類分析和PCA、PLS-DA結(jié)果均顯示，10批水冬瓜葉可分為2類，其中，Y10聚為一類、其余聚為一類;經(jīng)PLS-DA分析，篩選出了6個變量投影重要性值大于1的共有峰（峰4、3、10、2、6、11）。10批樣品中金絲桃苷和異槲皮苷的平均含量分別為0.47～6.97、0.21～1.87 mg/g。結(jié)論：所建立的HPLC指紋圖譜和含量測定方法穩(wěn)定、可靠，初步篩選出了不同產(chǎn)地水冬瓜葉中金絲桃苷等6個質(zhì)量差異性標(biāo)志物，可用于不同產(chǎn)地水冬瓜葉藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 水冬瓜葉;指紋圖譜;化學(xué)模式識別;高效液相色譜;金絲桃苷;異槲皮苷

Establishment of HPLC Fingerprint， Chemical Pattern Recognition Analysis and Content Determination of the Leaves of Toricellia angulata from Different Regions

HAN Zhongyao1，XIANG Jun1，CHEN Jianyu2，SONG Yiyong1，LI Shiwai1，TANG Wenshuang1，YE Zujun1， ZHANG Linsu1，TIAN Hao1，WANG Wanle1（1. Dept. of Pharmacy， Qiannan Medical College for Nationalities， Guizhou Duyun 558000， China; 2. Pesticide National Engineering Research Center， Nankai University， Tianjin 300071， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To provide reference for the quality control of the leaves of Toricellia angulata. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agela Promosil C18 column with 0.2% phosphoric acid solution-acetonitrile （gradient elution） as mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 10 μL. HPLC fingerprint of 10 batches of the leaves of T. angulata was established and similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2004 edition）. The chromatographic peak was identified by comparing with the chromatogram of reference substance. Cluster analysis， PCA and PLS-DA were used to identify chemical patterns， and the quality differential markers were screened. The contents of hyperoside and isoquercitrin were determined by the same HPLC. RESULTS： The similarities of HPLC fingerprint of 10 batches of the leaves of T. angulata with control fingerprint were 0.923-0.983. A total of 11 common peaks were identified， and the peaks 4 and 5 were hyperoside and isoquercitrin， respectively. Results of cluster analysis， PCA and PLS-DA showed that 10 batches of leaves of T. angulata could be divided into two categories， Y10 was clustered into one category， and others were clustered into one category. PLS-DA analysis showed that 6 common peaks （peaks 4， 3， 10， 2， 6 and 11） with variable importance projection （VIP） greater than 1 were selected. Average contents of hyperoside and isoquercitrin in 10 batches of the leaves of T. angulata were 0.47-6.97， 0.21-1.87 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and the method for content determination are stable and reliable， and can be used for the quality control of the leaves of T. angulata from different areas. Six quality differential markers including hyperoside in the leaves of T. angulata from different areas are preliminarily screened.

KEYWORDS? ?Leaves of Toricellia angulata; Fingerprint; Chemical pattern recognition; HPLC; Hyperoside; Isoquer- citrin

水冬瓜葉又稱大接骨丹葉，為山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia Angulata Oliv. var. intermedia（Harms）Hu的干燥葉[1]。為貴州省少數(shù)民族用藥，在黔南布依族苗族自治州轄區(qū)的苗族聚集地用作“苗藥”，在水族聚集地用作“水藥”。目前，該藥暫未收載于2020版《中國藥典》及2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中。據(jù)《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》《湖北中草藥志》等標(biāo)準(zhǔn)記載，有齒鞘柄木是以根皮入藥[1-2];但《中華本草（苗藥卷）》中卻指出，有齒鞘柄木是以根、根皮、樹皮和葉入藥[3]。據(jù)調(diào)研，依據(jù)有齒鞘柄木植物體生長期內(nèi)冬季落葉與早春萌芽（通常3月中旬）的特性，有齒鞘柄木在少數(shù)民族聚集地民間或民族醫(yī)療機構(gòu)臨床應(yīng)用時，呈現(xiàn)出春、夏、秋季用“葉”，而冬季、初春用根皮的習(xí)藥特點，且水冬瓜葉為部分民族醫(yī)療機構(gòu)治療骨折或摔傷愈合院內(nèi)制劑的重要組成成分之一，這提示有齒鞘柄木的地上部位——水冬瓜葉具有一定的藥用開發(fā)研究價值。

當(dāng)前針對有齒鞘柄木的研究主要集中在其不同用藥部位中紫丁香苷、總黃酮含量的經(jīng)時變化特征分析和根皮部位的化學(xué)成分、生物活性、工藝優(yōu)化、質(zhì)量控制以及樹皮部位的抗炎、鎮(zhèn)痛活性上[4-14]，本課題組前期也建立了有齒鞘柄木根皮和樹皮部位成分分析的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜[15-17]，但目前關(guān)于有齒鞘柄木地上部分——水冬瓜葉成分分析的報道仍較少。鑒于此，本研究擬在前期研究的方法基礎(chǔ)上，以不同產(chǎn)地的水冬瓜葉為研究對象，建立其HPLC指紋圖譜;利用化學(xué)模式識別法對其進行質(zhì)量差異性評價，篩選出質(zhì)量差異標(biāo)志物;并同時測定指認(rèn)出的主要成分的含量，以期為水冬瓜葉藥材的質(zhì)量控制、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂及民間、臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

1260型HPLC儀購自美國Agilent公司;FA1004B型萬分之一電子天平購自溫州瑞昕儀器有限公司;PX125DZH型十萬分之一電子天平購自成都川弘科生物技術(shù)有限公司;KQ3200型超聲儀購自昆山市超聲儀器有限公司;WK-1000A型高速粉碎機購自濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

10批水冬瓜葉藥材均于2020年6-10月由本課題組自行采集（其來源信息見表1），經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系韓忠耀副教授鑒定均為山茱萸科植物有齒鞘柄木T. Angulata Oliv. var. intermedia（Harms）Hu的葉。所有藥材均于58 ℃下烘干，粉碎后過四號篩，備用。

金絲桃苷對照品（批號CHB180214，純度≥98%）、異槲皮苷對照品（批號CHB180628，純度≥98%）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agela Promosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（C），梯度洗脫（0～20 min，10%C→13%C;20～25 min，13%C→19%C;25～40 min，19%C→25%C;40～50 min，25%C→45%C;50～65 min，45%C→70%C;65～65.1 min，70%C→10%C;65.1～70 min，10%C）;檢測波長為210 nm;柱溫為35 ℃;流速為1.0 mL/min;進樣量為10 μL;運行時間為70 min。

2.2 水冬瓜葉HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.2.1 混合對照品溶液 分別取金絲桃苷、異槲皮苷對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，先加適量甲醇超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理2 min，再加甲醇稀釋到刻度，搖勻，即得金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為0.089 0、0.083 0 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取藥材粉末1.0 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL，加熱回流提取60 min，放冷，過濾;收集濾液于100 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。用0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液，即得。

2.2.3 精密度試驗 取同一份樣品（編號Y9）粉末適量，按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，再按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以4號峰（該峰保留時間居中、峰形較好且峰面積穩(wěn)定）為參照，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均不高于1.56%、相對峰面積的RSD均不高于2.17%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗 取同一份樣品（編號Y9）粉末適量，精密稱取6份，分別按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，再按照“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。以4號峰為參照，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均不高于0.95%、相對峰面積的RSD均不高于2.89%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份樣品（編號Y9）粉末適量，按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、6、10、12、24 h時按照“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。以4號峰為參照，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均不高于2.21%、相對峰面積的RSD均不高于3.00%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 10批水冬瓜葉HPLC指紋圖譜的建立、相似度評價及色譜峰的指認(rèn) 分別取10批樣品粉末，按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液。取“2.2.1”項下混合對照品溶液及10批樣品的供試品溶液，分別按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。然后，將10批樣品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A版）》中，以Y1樣品的圖譜為參照圖譜進行共有峰匹配，設(shè)置時間窗寬度為0.2 min，生成疊加圖譜，采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），并進行相似度評價。通過比對混合對照品色譜圖（按同一色譜條件測得）和對照指紋圖譜（R）中各色譜峰的出峰時間，進行色譜峰的指認(rèn)。結(jié)果，共得到11個共有成分峰，并指認(rèn)出峰4、5分別為金絲桃苷和異槲皮苷。以色譜峰4（金絲桃苷）為參照（Y）計算得到11個共有峰相對保留時間的RSD均不高于0.39%;相對峰面積的RSD值波動較大，為27.05%～156.07%（除參照峰外）。以上結(jié)果表明，不同產(chǎn)地水冬瓜葉中化學(xué)成分組成相似，但含量差異較大。相似度評價結(jié)果顯示，10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉圖譜與對照指紋圖譜（R）的相似度為0.923～0.983，表明不同產(chǎn)地水冬瓜葉藥材間化學(xué)成分種類相似度較高，藥材質(zhì)量整體穩(wěn)定、可控。10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉HPLC疊加圖譜、對照指紋圖譜分別見圖1、圖2，金絲桃苷和異槲皮苷混合對照品的HPLC圖見圖3，11個共有峰相對保留時間、相對峰面積的測定結(jié)果分別見表2、表3，10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉的相似度評價結(jié)果見表4。

2.3 化學(xué)模式識別分析

2.3.1 聚類分析 以10批樣品的11個共有峰峰面積為變量，分別將其導(dǎo)入SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件中，采用組間均聯(lián)法，選擇平方Euclideam距離為測度進行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)分類距離約為5時，10批樣品可被分為2類：其中，編號為Y10的樣品單獨聚為一類;其他批次的樣品聚為另一類。10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉的聚類分析樹狀圖見圖4。

2.3.2 主成分分析 將10批樣品的11個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P+12.0.0.0軟件中進行主成分分析（PCA），繪制PCA得分散點圖。結(jié)果顯示，10批樣品大致可聚為2類，與聚類分析結(jié)果基本一致。10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉的PCA得分散點圖見圖5。

2.3.3 偏最小二乘法-判別分析 參照文獻[17-18]，將10批樣品的11個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P+12.0.0.0軟件中進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），繪制PLS-DA散點得分圖。結(jié)果顯示，10批樣品大致可聚為2類，與聚類分析結(jié)果基本一致;所建模型變量解釋度R 2Y為0.945，模型預(yù)測度Q 2為0.902，表明此模型穩(wěn)定、可靠。10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉的PLS-DA散點得分圖見圖6。

為找出10批樣品中差異貢獻度大的成分，提取了模型中11個共有峰所代表化學(xué)成分的變量投影重要性（VIP）值，并將VIP值大于1的成分確定為貢獻較大的成分[19]。結(jié)果顯示，11個共有峰的VIP值均大于0.50，VIP值普遍較高，證實了峰1～11作為不同產(chǎn)地水冬瓜葉質(zhì)量差異性化學(xué)成分具有較典型的代表性與構(gòu)建的HPLC指紋圖譜共有峰的科學(xué)性[20]。其中，峰4、3、10、2、6、11這共6個共有峰峰面積的VIP值大于1，可初步擬定為不同產(chǎn)地水冬瓜葉的質(zhì)量差異性標(biāo)志物。10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉中11個共有峰的VIP值測定結(jié)果見圖7。

2.4 金絲桃苷、異槲皮苷的含量測定

2.4.1 金絲桃苷、異槲皮苷混合貯備液的制備 分別取金絲桃苷、異槲皮苷對照品適量，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解后，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為0.136 9、0.039 6 mg/mL的混合對照品貯備液。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密“2.4.1”項下混合對照品貯備液0.5、1.0、2.0、5.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得1～4號混合對照品溶液。另取1號混合對照品溶液5 mL置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0號混合對照品溶液。精密吸取上述混合對照品溶液（0～4號）和混合對照品貯備液（5號）各10 μL，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作線性回歸，得到金絲桃苷、異槲皮苷的線性回歸方程分別為Y=8 103.7X+27.906（r=0.999 7）、Y=54 478X-5.390 2（r=0.999 9），其檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.003 42～0.136 90、0.000 99～0.039 60 mg/mL。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取“2.4.2”項下3號混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為2.93%、1.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品（編號Y10）粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、6、10、12、24 h時按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為0.15%、2.35%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取同一樣品（編號Y10）粉末共6份，每份0.5 g，精密稱定，分別按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并根據(jù)外標(biāo)法分別計算金絲桃苷、異槲皮苷的含量。結(jié)果，金絲桃苷、異槲皮苷含量的RSD分別為2.82%、2.87%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的樣品（編號Y1）粉末0.5 g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品貯備液（按“2.4.1”項下方法另配制金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為0.129 8、0.053 4 mg/mL的混合對照品溶液）2 mL，再分別加入甲醇98 mL，其余按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，然后按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。采用外標(biāo)法分別計算樣品中金絲桃苷、異槲皮苷的含量，并計算其加樣回收率。結(jié)果，金絲桃苷、異槲皮苷的平均加樣回收率分別為102.51%、99.16%，RSD分別為2.05%、2.58%（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度高。金絲桃苷、異槲皮苷的加樣回收率測定結(jié)果見表5。

2.4.7 含量測定 分別稱取10批樣品粉末約2 g，按照“2.2.2”項下方法制成供試品溶液后，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并采用外標(biāo)法分別計算樣品中金絲桃苷、異槲皮苷的含量。每批樣品重復(fù)測定3次，取平均值。結(jié)果，10批樣品中金絲桃苷、異槲皮苷的平均含量分別為0.47～6.97、0.21～1.87 mg/g，詳見表6。

3 討論

3.1 樣品提取方法和提取溶劑考察

在前期預(yù)實驗中，筆者分別考察了浸漬、超聲、回流等不同提取方法對樣品HPLC指紋圖譜的影響，同時考察了水、10%～90%乙醇、無水乙醇以及不同體積分?jǐn)?shù)甲醇（10%～90%）等不同提取溶劑對樣品HPLC指紋圖譜的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇為提取溶劑且采用水浴回流提取時，樣品的出峰最為豐富且峰形較好，故最終確定了本研究的提取溶劑與提取方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

前期筆者采用二極管陣列檢測器分別考察了樣品在210、220、230、240、250、260、270、280 nm等不同波長下的響應(yīng)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在210 nm波長下，樣品的出峰數(shù)量最多且響應(yīng)普遍較強，故最終確定以210 nm作為本研究的檢測波長。此外，筆者還考察了5、10、20 μL的進樣量對樣品色譜峰峰形及分離度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進樣量為10 μL時，樣品中色譜峰的峰形較好且共有峰的分離度均符合分析檢測要求，因此本研究將10 μL作為進樣量。同時，筆者也考察了以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液、甲醇-0.2%醋酸水溶液、甲醇-0.5%醋酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.5%磷酸水溶液、乙腈-0.2%醋酸水溶液、乙腈-0.5%醋酸水溶液等作為流動相時對樣品色譜圖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以乙腈-0.2%磷酸水溶液和乙腈-0.5%磷酸水溶液為流動相時，樣品中各色譜峰的峰形較好且分離度較高，但考慮到流動相中磷酸濃度過高對色譜柱和液相操作系統(tǒng)的不良影響，故本研究最終選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相。

3.3 水冬瓜葉藥材質(zhì)量綜合評價分析

本研究基于HPLC指紋圖譜技術(shù)，通過相似度分析初步評價了10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉藥材的相似性。同時，本研究利用PCA和PLS-DA等化學(xué)模式識別分析技術(shù)評價了不同產(chǎn)地水冬瓜葉藥材間的質(zhì)量差異，初步篩選出了影響不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量的6個質(zhì)量差異性標(biāo)志物。由相關(guān)文獻報道可知，金絲桃苷具有保護心肌缺血/再灌注損傷等活性[21]，異槲皮苷具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、保護神經(jīng)等生物活性[22]。為進一步深入評價藥材質(zhì)量，故本研究對民族藥水冬瓜葉中的代表性成分金絲桃苷和異槲皮苷進行了定量分析。10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉藥材的含量測定結(jié)果顯示，編號為Y1（采集于貴州沿河縣）、Y4（采集于貴州福泉市）的樣品中金絲桃苷、異槲皮苷的含量均較低，提示這2批樣品中上述成分的含量與其他批次差異較大。分析其原因，可能與藥材生長的海拔、土壤、光照、水源、溫度等影響因素有關(guān)，相關(guān)研究有待進一步深入。

綜上所述，本研究建立了10批不同產(chǎn)地水冬瓜葉的HPLC指紋圖譜，共確立了11個共有峰，結(jié)合PCA和PLS-DA等化學(xué)模式識別評價方法初步篩選出了影響不同產(chǎn)地水冬瓜葉質(zhì)量的6個差異性標(biāo)志物，并對不同產(chǎn)地水冬瓜葉主要化學(xué)成分金絲桃苷和異槲皮苷進行了含量測定。所建立的HPLC指紋圖譜和含量測定方法穩(wěn)定、可靠，可用于水冬瓜葉藥材的質(zhì)量控制，化學(xué)模式識別法初篩的質(zhì)量差異性標(biāo)志物也為后期深入研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻

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（收稿日期：2021-02-01 修回日期：2021-04-13）

（編輯：林 靜）