HPLC法測(cè)定維生素D₃軟膠囊中抗氧劑二丁基羥基甲苯的含量

周惠惠 胡立學(xué) 劉佳佳 梅興國(guó)

【摘 要】 目的：建立測(cè)定維生素D3軟膠囊中抗氧劑二丁基羥基甲苯（BHT）含量的方法。方法：色譜柱為DiamonsilC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水、甲醇-乙醇（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果： BHT濃度在5.44～16.31 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.9999，n=5）;精密度、重復(fù)性、溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于3%;平均回收率為98.2%，RSD為1.52%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，可用于維生素D3軟膠囊中BHT的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 二丁基羥基甲苯;含量測(cè)定;HPLC法

【中圖分類號(hào)】R927.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）08-0026-04

Abstract：Objective To establish a method for the determination of the antioxidant dibutyl hydroxytoluene （BHT） in vitamin D3 soft capsules.Methods the chromatographic column was Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm， 5 m）， the mobile phase was methanol-water and methanol-ethanol （gradient elution）， the flow rate was 1.0 mL/min， the detection wavelength was 278 nm， the column temperature was 35 ℃， and the injection volume was 20 μL.Results The linear range of BHT was 5.44～16.31 μg/mL （R2=0.9997， n=5）.The quantitative limit and detection limit are respectively;The RSD of precision， repeatability and solution stability test were all less than 3%.The average recovery was 98.2% and RSD 1.13%.Conclusion The method is simple， reproducible and accurate， and can be used for the determination of BHT in vitamin D3 soft capsule.

Key words：Dibutyl Hydroxytoluene;Determination of Content;HPLC

二丁基羥基甲苯（Butylated hydroxytoluene，BHT）作為一種脂溶性抗氧劑，穩(wěn)定性高，抗氧化能力強(qiáng)，是我國(guó)生產(chǎn)量最大的抗氧化劑之一，常用于食品、保健品、藥品中[1]。2020版中國(guó)藥典[2]中收錄該品種的含量測(cè)定采用高效液相色譜法，也有文獻(xiàn)[3-4]采用氣相色譜法。本文參照2020版中國(guó)藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，建立了高效液相色譜法測(cè)定維生素D3軟膠囊中抗氧劑BHT的含量，現(xiàn)報(bào)導(dǎo)如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 40D高效液相色譜儀（島津公司）;XSE105電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）;XW-80A渦旋混合儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試藥 甲醇為色譜純（天津賽孚瑞科技有限公司）;乙醇為色譜純（天津賽孚瑞科技有限公司）;純化水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）;二丁基羥基甲苯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)190065-201602）;維生素D3軟膠囊（批號(hào)200617、200712、200723，自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：A相為甲醇-水（9∶[KG-*3/5]1）、B相為甲醇-乙醇（8∶[KG-*3/5]2），梯度洗脫（0～10 min時(shí)為A;10～30 min時(shí)為B;30～40 min時(shí)為A）;檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm;柱溫：35 ℃;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 稱取BHT對(duì)照品約10mg置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為BHT儲(chǔ)備液。精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。[JP]

2.2.2 [JP+1]供試品溶液的配制 稱取維生素D3軟膠囊內(nèi)容物適量（相當(dāng)于BHT 0.2 mg）置20 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解渦旋5 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置分層，取上清液過(guò)濾進(jìn)樣。[JP]

2.2.3 空白溶液的配制 按處方組成及工藝制備不含BHT的空白輔料，按“2.2.2”供試品溶液的配制方法進(jìn)行配制空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 按照“2.1”色譜條件下，分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，觀察在主峰出峰位置是否有干擾。結(jié)果顯示，在278 nm處，供試品溶液中的BHT保留時(shí)間約為7 min與對(duì)照品溶液保留時(shí)間相同，空白溶液在主峰位置無(wú)干擾。色譜圖如圖1所示。

2.3.2 線性考察 精密稱量BHT對(duì)照品約10.87 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得108.7 μg/mL的對(duì)照儲(chǔ)備液。用甲醇溶液逐級(jí)稀釋，制得濃度分別為5.44 μg/mL、8.70 μg/mL、10.87 μg/mL、13.04 μg/mL、16.31 μg/mL的對(duì)照品溶液。按照2.3.2項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積（y）對(duì)濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=10067.15x-1031.8[BF]，（[BFQ]R2=0.9999）。結(jié)果表明，在5.44～16.31 μg/mL范圍內(nèi)，BHT峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。如圖2所示。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液（10 μg/mL）重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果BHT峰面積RSD為0.30%，表明儀器精密度良好，色譜條件穩(wěn)定。見(jiàn)表1。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批的樣品（批號(hào)為200617）平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果RSD為1.02%，表明本方法重復(fù)性良好。見(jiàn)表2。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 稱取BHT對(duì)照品約10 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為BHT儲(chǔ)備液溶液。精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為BHT對(duì)照品溶液，平行配置2份。精密稱量9份空白輔料（按處方比例不加入BHT）置50 mL量瓶，分3組，每組3份，各組分別精密加入BHT對(duì)照儲(chǔ)備液4 mL、5 mL、6 mL，（分別相當(dāng)于BHT處方量的80%、100%和120%），加入適量甲醇溶解并渦旋5 min，用同樣的溶劑稀釋并至刻度，靜置分層，配制成低、中、高三種濃度的供試品溶液，取上清液過(guò)濾，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率及RSD值。結(jié)果表明平均回收率98.2%，RSD為1.52%。見(jiàn)表3。

2.3.6 溶液穩(wěn)定性 取自制樣品（200723批）按“2.2.2”項(xiàng)制備成供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h，按“2.3.2”色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示：BHT的RSD值為0.66，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表4。

2.4 樣品含量測(cè)定 取三批樣品（200617、200712、200723批）按照“2.2.2”項(xiàng)配制供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算含量。結(jié)果顯示含量符合要求。見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 用甲醇配制成一定濃度的二丁基羥基甲苯（BHT）對(duì)照品溶液，在200～400 nm之間進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描。掃描結(jié)果顯示，BHT在278 nm處有最大吸收峰，因此將選擇278 nm為BHT含量測(cè)定檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 2020版中國(guó)藥典BHT含量測(cè)定記錄流動(dòng)相為甲醇-水（9∶[KG-*3/5]1），但本制劑內(nèi)容物中含有植物油，在BHT出峰附近有較大的雜質(zhì)峰，因此，筆者選擇流動(dòng)相甲醇-水（9∶[KG-*3/5]1）及甲醇-乙醇（8∶[KG-*3/5]2）進(jìn)行梯度洗脫，使植物油洗脫出來(lái)同時(shí)不干擾BHT的含量測(cè)定。

3.3 提取方法的選擇 BHT可溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，不溶于水，本實(shí)驗(yàn)研究的是從植物油中提取BHT，筆者選擇極性更大的甲醇作為提取溶劑，在提取次數(shù)上考察一次提取與三次提取BHT含量的多少，結(jié)果顯示兩者含量無(wú)明顯差別，因此選擇用甲醇一次提取的作為樣品處理方法。

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（收稿日期：2020-10-04 編輯：劉 斌）