地涌金蓮MlCYP734A6基因的克隆與表達分析

安 靜，萬友名，馬 宏，劉雄芳，張秀姣，曹毓蓉，李正紅

(中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224)

油菜素甾醇（BRs）是一類在植物生長發育過程中發揮重要調節作用的甾醇類化合物的總稱，作為植物的第六大內源激素，BRs廣泛存在于低等和高等植物中，尤其是被子植物中，而且存在于植物的各個組織器官中[1-2]。目前，從自然界分離鑒定出的BRs已經超過了70種，其中，被認為分布最廣泛且活性最強的是油菜素內酯（BL），通常被人們用來指代BRs[3-4]。BRs在植物整個生長發育和環境適應過程中發揮著重要的作用，尤其調控著許多重要的農藝性狀，如植物結構、開花時間、種子產量和抗逆性等[5-8]。微劑量的BRs就可以顯著促進植物生長，但過量的BRs則抑制植物的生長發育，因此，維持和調節內源BRs水平對植物的最佳生長發育狀態至關重要[9]。植物的生長發育主要受環境因素和各種植物激素的調控，已有多篇文獻證明油菜素內酯與不同的植物激素如生長素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯、赤霉素、茉莉酸、多胺、水楊酸等相互作用，引發植物代謝及其生長發育的各種反應[10]。對BRs的研究近10多年一直呈逐年上升的態勢[11]。

由于BRs不能進行組織和器官間的長距離運輸，所以BRs的生物合成和分解代謝是維持BRs在植物體內穩態含量的兩個關鍵拮抗過程[12-13]。目前，幾乎完整的BRs生物合成及代謝途徑已經被解析出來[14-16]。BRs代謝通路上最關鍵的失活基因CYP734As已經在多種植物中被挖掘及研究[17-22]。CYP734As基因屬于細胞色素P450酶家族，在BRs失活過程中發揮著關鍵作用，可以催化BL和栗甾酮（CS）的C26位置上發生羥基化，使BRs失活，從而下調植物體內活性BRs水平[8,23]。BAS1/CYP734A1是第一個被研究報道出來對BRs失活有明確羥基化作用的基因，在擬南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.）中過表達AtCYP734A1可導致植物體內BRs含量下降，植株出現極度矮化、葉片緊縮的表型[17]。而后，該基因的同源基因在其他植物中被陸續研究報道，番茄（Solanum lycopersicumMill）中 的CYP734A7、棉 花（Gossypium hirsutumL.）中的PAG1、胡蘿卜（Daucus carotaL.）中的DcBAS1以及水稻（Oryza sativaL.）中的CYP734As，都被研究證實了具有使BRs失活的功能[18-20,22]。內源活性BRs具有反饋機制，當含量多時會下調合成基因和上調代謝基因，CYP734As的上調表達通常是由于BRs的反饋調控引起的[24]。CYP734As基因還受到其他影響因子的正負調控，有報道稱，BAS1基因的表達受到轉錄因子BZR1和生長素響應因子ARF7的反向調控，二者都與BAS1啟動子中的相同motifs結合，ARF7可抑制BAS1的表達或促進BRs生物合成基因DWF4的表達，來增加內源性BRs含量[25]。

地涌金蓮（Musella lasiocarpa(Franchet) C. Y.Wu ex H. W. Li.）是中國金沙江河谷流域的特有珍稀單種屬植物，屬于芭蕉科（Musoideae）地涌金蓮屬（Musella），具有優美奇特的蓮座狀花序及端正筆挺的株形，文化及觀賞價值極高。本研究組率先找到了幾處地涌金蓮野生種群，從中發現了株高、苞片顏色、吸芽數量等性狀的不同變異類型，并注冊登記了5個地涌金蓮新品種[26-27]。筆者從前期高桿和矮桿2個無性系的轉錄組數據庫中發現，與BRs代謝相關的CYP734A6基因的表達水平在矮桿品系中顯著高于高桿品系，由此推測，地涌金蓮植株高矮性狀可能與CYP734A6基因的差異表達導致BRs含量不同相關。為進一步探究地涌金蓮中CYP734A6基因的相關信息及表達規律，本研究克隆得到了MlCYP734A6基因的cDNA序列全長，并對其編碼蛋白的理化性質、結構特征和系統進化進行了分析，同時應用qRT-PCR分析了MlCYP734A6基因在不同地涌金蓮類型及不同組織部位中的表達模式，并與油菜素內酯含量做了相關性分析，以期為探究MlCYP734A6基因在地涌金蓮生長發育過程中的調控作用提供分子依據，對今后采用分子手段培育不同株形性狀新品種也具參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料種植于中國林業科學研究院資源昆蟲研究所位于云南省祿豐縣的滇中高原試驗站。以地涌金蓮矮桿類型（RD05）和高桿類型（YN01）為試驗材料，二者均為來自于單株的組培苗無性系。2019年5月，從定植3 a的2個無性系中各隨機選擇30株調查平均株高，測量數據（RD05: 21.50 ±4.31 cm, YN01: 54.74 ± 6.06 cm）顯示二者存在極顯著差異（p＜ 0.01）；各隨機選擇3株長勢健壯的初花期植株，分別取每株的苞片、花序軸（假莖中間的莖稈）、葉、吸芽芽點及根尖5個部位為樣品，每個部位至少3 g，采集的樣品立即放入液氮中，隨后保存于-80°C冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA第一鏈合成 采用CTAB法[28]提取地涌金蓮樣品總RNA；采用1.0%瓊脂凝膠電泳和NanoDrop2000微量分光光度計檢測RNA質量；按照Fermentas公司的反轉錄試劑盒VRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書中的步驟合成cDNA第一鏈。

1.2.2MlCYP734A6基因的克隆 根據本研究組前期地涌金蓮轉錄組信息（材料來源與本研究相同），在油菜素內酯代謝通路上篩選到1個注釋為CYP734A6的顯著差異基因片段，采用Primer Premier 5.0軟件設計2條特異性擴增引物QA029F2和QA029R1（表1）。以RD05的5個部位材料等量混合提取RNA后反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系為：2 × PCR Buffer for KOD FX Neo 25.0 μL，dNTP Mix (10 mmol·L-1) 1.0 μL，KOD FX Neo (1 U·μL-1)1.0 μL，cDNA第一鏈5.0 μL，ddH2O 15.0 μL，正反引物各1.5 μL。PCR擴增程序為：98℃預變性5 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2.5 min，35個循環；72℃延伸10 min。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

PCR擴增產物經1.0%瓊脂凝膠電泳檢測合格，回收目的條帶，使用TaKaRa公司的T4連接酶試劑盒進行連接后，4℃過夜，采用感受態細胞進行轉化，獲得陽性克隆后交由上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.3MlCYP734A6基因的生物信息學分析 應用NCBI網站中的ORF finder和CDD功能查找克隆獲得的全長序列的開放閱讀框和保守結構域；應用Expasy網站（https://www.expasy.org/）中的ProtParam和Protscale在線軟件分析蛋白的理化性質和親疏水性；應用DTU.dk網站（https://services.healthtech.dtu.dk/）中的SignaIP5.0、NetPhos3.1和TMHMM2.0在線軟件預測蛋白的信號肽、磷酸化位點和跨膜結構；使用BUSCA（http://busca.biocomp.unibo.it/）和SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html）在線軟件預測蛋白的亞細胞定位和蛋白的二級結構模型；應用DNAMAN8.0軟件進行氨基酸序列比對；應用MEGA6.0軟件的鄰接法（Neighbor-joining）進行系統進化分析，以上在線分析軟件的設置系數皆為系統默認值。

1.2.4MlCYP734A6基因的實時熒光定量分析 根據地涌金蓮MlCYP734A6基因全長序列設計出1對熒光定量特異性引物AJ17F和AJ17R，擴增產物長度為146 bp，以地涌金蓮TUBA為內參基因，設計內參引物TUBAF和TUBAR，擴增產物長度為190 bp（表1）。分別以地涌金蓮RD05和YN01的苞片、花序軸、葉、吸芽芽點及根尖部位的cDNA為模板，對MlCYP734A6進行定量表達分析。儀器為BIO-RAD CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統，采用Power SYBR?Green PCR Master Mix (Applied Biosystems?Cat: 4 367 659)試劑盒，反應體系為20 μL，反應程序為：95.0℃預變性3 min；95.0℃ 10 s，55.0℃ 20 s，72.0℃ 20 s，75.0℃ 5 s，40個循環。每個樣品設置3次重復，采用2-ΔΔCT方法進行數據分析，利用SPSS軟件中的ANONA模塊進行Duncan多重比較法進行數據的顯著性差異分析。

1.2.5 油菜素內酯的提取與檢測 取地涌金蓮RD05和YN01各3株的苞片、花序軸、葉、吸芽芽點及根尖5個部位為油菜素內酯檢測材料，每個部位至少3 g，交由南京卡文思檢測技術有限公司采用高效液相色譜-質譜聯用方法（HPLC-MS/MS）進行BL含量測定，每個樣品重復3次。檢測濃度帶入公式：BL含量（ng·g-1）= 檢測濃度（ng·mL-1）× 體積系數（mL）/質量系數（g），式中體積系數為0.20 mL，質量系數為樣品實際稱取質量。應用SPSS軟件中的雙變量相關性計算方法，計算皮爾遜相關系數r值和顯著性P值，對MlCYP734A6及油菜素內酯含量進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 地涌金蓮MlCYP734A6基因的克隆及生物信息學分析

以地涌金蓮RD05的cDNA為模版，應用特異性引物對目的基因進行PCR擴增，電泳結果顯示：在位于1 000～2 000 bp間有1條與預期大小相符的條帶，經回收、測序后，顯示該片段實際大小為1 639 bp（圖1）。結合3′和5′ RACE技術，拼接出地涌金蓮CYP734A6的基因序列全長，命名為MlCYP734A6（GenBank登錄號MW013148）。該基因全長為1 936 bp，其中，5′非編碼區長度為131 bp，3′非編碼區長度為221 bp，包括長度為118 bp的polyA尾巴（圖2）。

圖1 MlCYP734A6的PCR擴增產物Fig.1 PCR amplification of MlCYP734A6

圖2 地涌金蓮MlCYP734A6基因的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and amino acid sequence coded of MlCYP734A6

MlCYP734A6包含1個長度為1 584 bp的完整開放閱讀框，編碼527個氨基酸，存在1個細胞色素P450蛋白家族結構域。TMHMM在線預測該蛋白在7～29氨基酸殘基位置存有1個螺旋跨膜區域；SignalP5.0在線預測無信號肽位點，屬于非分泌性蛋白質；BUSCA在線預測蛋白亞細胞定位于細胞質膜；蛋白二級結構預測結果顯示，該蛋白包含51.04%的α-螺旋、12.14%的延長鏈、5.31%的β-折疊和31.50%的無規則卷曲（圖3）。理化性質分析結果推測出，MlCYP734A6蛋白的分子式為C2728H4287N751O737S20，相對分子量為60 038.84 Da，等電點為9.44，酸性氨基酸殘基總數(Asp+Glu)為54，堿性氨基酸殘基總數(Arg+Lys)為67，穩定性系數為44.32，屬于不穩定蛋白，脂肪系數為94.00；Protscale在線分析結果顯示，總平均親水性（GRAVY）為-0.111，推測MlCYP734A6為親水性蛋白(圖4A)；磷酸化位點預測結果顯示，磷酸化位點有40處，其中，絲氨酸19處、蘇氨酸17處、絡氨酸4處（圖4B）。

圖3 MlCYP734A6蛋白的二級結構預測Fig.3 Secondary structure prediction of MlCYP734A6

圖4 MlCYP734A6的親/疏水性分析和磷酸化位點分析Fig.4 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis and phosphorylation sites analysis of MlCYP734A6

2.2 氨基酸序列比對及系統進化分析

將地涌金蓮MlCYP734A6編碼的氨基酸序列與其他植物進行比對，發現與多種植物的相似性達到75%以上，其中，與小果野蕉亞種（Musa acuminatasubsp.malaccensis）的相似性最高，達到94.69%，其次是鳳梨（Ananas comosus(L.) Merr.）和油棕（Elaeis guineensisJacq.），分別為73.66%和73.33%。應用DNAMAN8.0軟件將MlCYP734A6氨基酸序列與相似度比較高的幾種植物進行比對分析，顯示這幾種植物均存在1個結構相似的細胞色素P450蛋白家族結構域（圖5）。

圖5 地涌金蓮與其他植物的CYP734A6氨基酸序列比對Fig.5 The alignment of amino acid sequences of CYP734A6 in M. lasiocarpa and other plants

為了分析CYP734A6在不同植物間的親緣關系，應用MEGA6.0軟件，采用Neighbor-joining方法將地涌金蓮MlCYP734A6與其他14種植物的同源蛋白進行系統進化分析，聚類結果顯示，地涌金蓮MlCYP734A6與小果野蕉亞種和油棕的同源蛋白遺傳關系最近，而與黍（Panicum halliVasey.）、谷子（Setaria italica(L.) Beauv.）等單子葉植物遺傳關系較遠（圖6）。

圖6 地涌金蓮MlCYP734A6與其同源序列的系統進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of MlCYP734A6 of M. lasiocarpa and itshomologous

2.3 MlCYP734A6基因的表達模式分析

運用實時熒光定量PCR檢測MlCYP734A6基因在不同地涌金蓮類型和不同組織部位中的相對表達量，結果（圖7）表明：MlCYP734A6基因在2種類型地涌金蓮的所有組織中均有表達且相對表達量差異顯著（p＜ 0.05），矮桿類型地涌金蓮RD05的花序軸中MlCYP734A6的相對表達量最高，為15.722，其次是根尖、苞片和吸芽芽點，最低的部位是葉片，僅為0.907；高桿類型YN01中，根尖中的相對表達量最高，為2.589，其次是苞片、花序軸、芽點，最低的部位也是葉片，僅為0.444。2種類型地涌金蓮同一組織部位的比較分析結果顯示，RD05在各個組織部位的相對表達量皆高于YN01，RD05的花序軸、根尖、苞片、吸芽芽點和葉片的相對表達量分別是YN01的14.13、5.08、4.47、1.28、2.04倍。

圖7 MlCYP734A6在不同類型地涌金蓮各組織中的相對表達量Fig.7 Relative expression of MlCYP734A6in different tissuesof M. lasiocarpa

2.4 油菜素內酯含量測定及與MlCYP734A6基因表達量水平的相關性分析

為了分析MlCYP734A6表達水平與油菜素內酯含量的相關性及地涌金蓮株高與油菜素內酯的關系，筆者采用HPLC-MS/MS分別測定了2個類型地涌金蓮5個組織部位的BL含量，檢測結果（圖8）顯示：地涌金蓮的5個組織部位皆能檢測出BL，但不同組織中BL含量差異顯著。在YN01中，葉片中的BL含量最高，為0.032 ng·g-1，其次是根尖、芽點、苞片和花序軸，分別是0.014、0.009、0.006、0.003 ng·g-1；在RD05中，苞片中的BL含量最高，為0.067 ng·g-1，其次是花序軸、芽點、葉片和根尖，分別是0.056、0.035、0.008、0.007 ng·g-1。結合MlCYP734A6的表達模式分析，YN01中的MlCYP734A6基因在葉中的表達水平最低，但BL含量卻最高，而MlCYP734A6在花序軸的表達量較高，但BL含量卻最低；在RD05中，花序軸中MlCYP734A6表達水平最高，但BL含量也較高，葉片中MlCYP734A6表達水平最低，BL含量也非常低。通過SPSS軟件對不同組織中MlCYP734A6基因表達水平和BL的相關性進行分析，計算結果（YN01:r值0.568，p值0.318；RD05:r值-0.212，p值0.732）顯示，二者之間不存在顯著相關性。

圖8 不同類型地涌金蓮不同組織中的BL含量Fig.8 The content of BL in different tissues of M. lasiocarpa

3 討論

本研究成功地從地涌金蓮中克隆到1個油菜素內酯代謝通路上的失活基因MlCYP734A6，通過多序列比對及系統進化分析，結果顯示該基因編碼的MlCYP734A6蛋白與同為芭蕉科的小果野蕉亞種的同源蛋白具有94.69%的高相似性，并且與其他植物的CYP734As進行比對，顯示都具有細胞色素P450蛋白家族結構域，說明CYP734As在生物演變過程中是高度保守的，即MlCYP734A6可能具有與其他CYP734As類似的使BRs羥基化的功能。

對地涌金蓮MlCYP734A6基因在不同株高類型地涌金蓮中的表達模式分析發現，MlCYP734A6在地涌金蓮不同組織部位的表達水平差異顯著，2種類型地涌金蓮分別在花序軸和根尖中的表達水平最高，這一結果與馬鈴薯StCYP734A1和水稻CYP734A6的表達模式類似，StCYP734A1在馬鈴薯的根中的表達水平最高，其次是莖，而水稻CYP734A6也是在莖節中的表達水平最高[21,29]。MlCYP734A6在地涌金蓮中的這種表達模式與棉花中的PAG1基因的表達模式相反，在地涌金蓮中，MlCYP734A6在花序軸和根尖中的表達水平最高，而在葉中的表達水平最低，而在棉花中，PAG1在根部和莖部的表達水平最低，在葉片中的表達水平最高[18]。由此可見，CYP734As基因在不同植物中的表達模式不盡相同，可能是由于BRs在不同植物的不同組織器官中行使著不同的功能，所以導致調控BRs含量的代謝基因CYP734As的表達模式差異很大。

分析HPLC-MS/MS檢測結果可知，BL在地涌金蓮各個組織器官中均可檢測到，且含量差異顯著，但與MlCYP734A6表達水平無顯著相關性。在YN01中，葉中的MlCYP734A6表達水平最低，而BL含量卻最高，花序軸中MlCYP734A6的表達水平較高，而BL含量卻最低，說明MlCYP734A6可能在YN01的花序軸的BRs代謝通路上起到重要的代謝調控作用，主效下調著BRs含量的積累；而在RD05中，苞片中的BL含量最高，而MlCYP734A6的表達水平有也較高，是YN01的14.13倍，推測苞片中BRs合成基因的表達水平可能比較高，與代謝基因MlCYP734A6共同調控著BRs含量水平，而且MlCYP734A6在RD05中的高表達水平可能也受到了高含量BRs的反饋上調調控[24]。

高桿類型YN01的平均株高是矮桿類型RD05的2.57倍，結合地涌金蓮轉錄組數據，前期分析篩選出BRs生物合成代謝途徑中有3個顯著差異Unigene，分別注釋為合成通路中的CYP90A1/CPD、CYP90B1/DWF4和代謝通路中的CYP734A6，而信號轉導通路中沒有顯著差異基因，這3個Unigene均是在RD05中顯著上調，其中，CYP734A6基因的表達量最高，顯著差異性最大，結合RD05的矮桿表型，故初期推測RD05中的BL含量應較低，但HPLC-MS/MS檢測結果與前期預測不符，檢測結果顯示，RD05花序軸中的BL含量是YN01的18.67倍。推測可能的原因是，雖然RD05中的代謝基因CYP734A6顯著上調，可使BRs含量下降，但合成通路中2個合成基因的顯著上調發揮更大的調控作用，導致合成量高于代謝量，在花序軸中積累了過量的BRs。由于BRs具有雙向調控的功能，缺乏或過量都會抑制植株生長，但目前對于過量BRs抑制植物生長的分子機理還尚未解析[29]，所以推測地涌金蓮RD05的矮化表型，可能是由于過量的內源BRs所致。植物的整個生長發育過程中，激素間的協同互作發揮著重要作用[30-31]。當BRs含量較高時，可抑制赤霉素的合成，從而抑制植物生長[29]。ABA作為植物生長抑制激素，雖然BRs在某些植物生理反應的調控中與ABA存在拮抗關系，但當BRs含量升高時，可上調若干個ABA響應基因和ABA生物合成基因[32]。故不排除其他激素對地涌金蓮株高上的影響。所以接下來可以對不同類型地涌金蓮在不同生長階段進行全激素含量檢測分析，并結合轉錄組數據進行激素和調控基因間的交互分析，為后續利用分子生物學技術改良地涌金蓮株形提供參考數據。

4 結論

本研究成功克隆了地涌金蓮MlCYP734A6基因，并分析了其編碼蛋白的序列結構及蛋白特性，明確了MlCYP734A6在地涌金蓮中的表達模式，分析了油菜素內酯與株高的關系。本研究結果為后續應用轉基因或RNAi技術等調控MlCYP734A6的表達來平衡地涌金蓮中油菜素內酯含量，進而為地涌金蓮的生長發育水平奠定了分子基礎，也為研究CYP734As在其他植物中的調控作用提供理論數據。