毛竹硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白家族PeNPFs基因鑒定及其表達(dá)特性分析

袁婷婷，朱成磊，楊克彬，宋新章，高志民＊

(1. 國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所，國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，北京 100102；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300)

氮是影響植物生長發(fā)育的重要礦質(zhì)營養(yǎng)元素，也是葉綠體、核酸、蛋白質(zhì)以及很多次生代謝產(chǎn)物的重要組成成分[1]。大多數(shù)陸生植物以硝態(tài)氮作為主要氮源，并以主動運輸?shù)姆绞綇耐獠凯h(huán)境吸收硝態(tài)氮，運輸?shù)狡渌M織器官中，供植物生長發(fā)育[2]。植物體內(nèi)的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運體( NRTs)負(fù)責(zé)從土壤中吸收硝態(tài)氮、植物體內(nèi)硝態(tài)氮的運輸和細(xì)胞內(nèi)硝態(tài)氮再分配，如NRT1、NRT2和NRT3等[3-4]。植物在進(jìn)化過程中形成2類不同的轉(zhuǎn)運蛋白，即高親和力轉(zhuǎn)運蛋白/系統(tǒng)( HATS)和低親和力轉(zhuǎn)運蛋白/系統(tǒng)(LATS)，它們又分別分為組成型(cHATS和cLATS)和誘導(dǎo)型(iHATS和iLATS)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtNRT1.1(CHL1)是高等植物中第1個被克隆的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白基因，它的突變導(dǎo)致硝態(tài)氮的吸收減少[5]，之后又在水稻(Oryza sativaL.)、玉米(Zea maysL.)和小麥(Triticum aestivumL.)中獲得了多種同源基因[6-8]。由于NRT1和PTR (Peptide transporter)成員序列同源性高，且能轉(zhuǎn)運種類廣泛的底物，它們被統(tǒng)一命名為NRT1/PTR FAMILY，即NPF家族[9]。

植物NPF蛋白可運輸硝態(tài)氮、多肽和脫落酸(ABA)等多種底物，是一個功能廣泛的家族，可分為8個亞家族[9-10]。研究表明，在擬南芥中AtNPF4.6負(fù)責(zé)硝態(tài)氮的吸收，它是一個組成型表達(dá)的低親和轉(zhuǎn)運蛋白，也可轉(zhuǎn)運ABA；AtNPF7.3介導(dǎo)硝態(tài)氮的木質(zhì)部裝載[11]；AtNPF1.2的作用是負(fù)責(zé)木質(zhì)部到韌皮部的轉(zhuǎn)移，將硝酸鹽重新分配到正在發(fā)育的葉片中[12]。水稻NPF8.9負(fù)責(zé)硝酸鹽的吸收，有2個不同剪接形式的轉(zhuǎn)錄本(NPF8.9a和NPF8.9b)，它們過表達(dá)可增加植株地上干質(zhì)量；OsNPF6.5作用于硝態(tài)氮的吸收和地上地下硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)運[13]。玉米中ZmNPF6.6是一個高親和硝酸鹽特異轉(zhuǎn)運蛋白，而ZmNPF6.4是一個低親和轉(zhuǎn)運蛋白，同時具有轉(zhuǎn)入和轉(zhuǎn)出硝酸鹽的雙向轉(zhuǎn)運活性[14]。NPF廣泛存在于多種植物中，且成員眾多，如擬南芥NPF家族有53個成員，水稻NPF家族有93個成員[13]，之后在黃瓜(Cucumis sativusL.)、毛果楊(Populus trichocarpaTorr. & Gray)、蘋果(Malus domesticaBorkh.)、甘蔗(Saccharum officinarumL.)中相繼鑒定了多個NPF成員[15-18]，而竹子中NPFs的相關(guān)研究尚屬空白。

竹子是禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物，其中，毛竹(Phyllostachys edulis(Carrière) J.Houz.)是最具特色的竹種之一，具有生長快、材性好、筍材兩用、固碳能力強(qiáng)等特點[19-20]。速生的特點，使得毛竹必須從外界吸收大量的氮素供其快速生長所需[21]，因此，生產(chǎn)中毛竹林施用氮肥非常普遍。在一定范圍內(nèi)(250 kg·hm-2)，隨著氮肥施用量增加，毛竹冬筍、春筍和竹材的產(chǎn)量均呈增加的趨勢[22]；然而，毛竹如何吸收利用氮素仍不清楚，其分子調(diào)節(jié)機(jī)制及對外界脅迫的響應(yīng)機(jī)制等均有待深入研究。NPF家族成員為氮素的重要運輸者，因此，開展毛竹NPF基因的鑒定與表達(dá)模式研究對于揭示其功能具有重要意義。本研究以毛竹為研究對象，利用已有基因組數(shù)據(jù)[23]對其中NPF家族基因成員進(jìn)行全面分析，包括基因啟動子、基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化等，并利用毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析NPF基因的組織表達(dá)特異性，以及非生物脅迫冷和干旱處理、激素GA3和NAA處理后的表達(dá)模式，以期為深入研究毛竹中NPF基因的功能奠定基礎(chǔ)，為探索毛竹快速生長發(fā)育期的氮素吸收利用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毛竹NPF基因序列獲取

分別從 Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)和Tair (https://www.arabidopsis.org/index.jsp)數(shù)據(jù)庫下載水稻和擬南芥NPF基因的CDS和氨基酸序列，作為誘餌序列在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫BambooGDB (http://bamboo.bamboogdb.org/)中進(jìn)行BlastP、BlastN (e-value=1e-10)比對，查找并獲取其中NPF同源基因的候選序列。對獲得的候選序列基于SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de)和PFAM數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org)逐條進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的鑒定和分析，僅保留具有編碼完整保守結(jié)構(gòu)域的序列，并進(jìn)行基因命名(PeNPFs)。

1.2 基于NPF同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為分析毛竹NPF成員的進(jìn)化關(guān)系，預(yù)測其潛在的功能，使用MEGA 7.0軟件的Clustal W功能對毛竹、水稻和擬南芥的NPF蛋白序列進(jìn)行同源比對分析，使用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap試驗重復(fù)1 000次[24]，其它參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

1.3 毛竹NPF基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白序列分析

使用Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線工具繪制PeNPFs的基因結(jié)構(gòu)圖，利用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線平臺分析其啟動子序列所含作用元件，用ProtParam (http://web.expasy.org/prot-param/)對毛竹NPF基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化特性進(jìn)行分析，使用MEME Version 5.1.0 (http://meme-suite.org/tools/meme)分析毛竹NPF蛋白的保守基序，使用Plant-mPLoc算法(http://www.csbio.sjtu.edu.cn)預(yù)測PeNPFs的亞細(xì)胞位置。

1.4 組織表達(dá)特異性分析

依據(jù)本實驗室前期毛竹7個不同組織(葉、早花期花序、盛花期花序、根、鞭、20 cm筍和50 cm筍)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[23]，用不同組織中NPF基因的RPKM (Reads Per Kilo-bases Per Million Reads)值表示基因的表達(dá)豐度，為有效地可視化展示基因表達(dá)量，對RPKM的值取以2為底的對數(shù)即Log2(RPKM)作為基因的表達(dá)量[25]。采用TBtools的熱圖工具[26]制作熱圖展示基因的表達(dá)情況，顏色由藍(lán)色到紅色逐步變化表示基因的表達(dá)豐度數(shù)值遞增。

1.5 獲得不同脅迫與激素處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

根據(jù)文獻(xiàn)查找，從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)下載獲取毛竹非生物脅迫和激素處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。冷和干旱處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)源自2年生毛竹，5株的離體枝條分別進(jìn)行冷(0℃和無光條件)和干旱(20℃和相對濕度50%條件)處理2 h后，每個處理分別選取10片未展葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，其RNA-seq數(shù)據(jù)登錄號為SRS-1759772[27]；GA3處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均源自毛竹實生苗，1個月的毛竹實生苗分別用水和100 μmol·L-1的GA3噴灑處理后4 h取整株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，其對照和處理的RNA-seq數(shù)據(jù)登錄號分別為SRS256-6465～SRS2566467、SRS2566468～SRS2566470[28]；NAA處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均源自1個月的毛竹實生苗，用5 μmol·L-1的NAA噴灑處理，間隔1 h處理1次，4 h后取根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，其對照和處理的RNA-seq數(shù)據(jù)登錄號分別為SRS2294012～SRS2294014、SRS2294015～SRS2294017[29]；上述處理取樣時均采用3次生物學(xué)重復(fù)。從這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因注釋中比對查找，篩選出對應(yīng)毛竹NPF基因的FPKM值，用于表達(dá)分析。

1.6 不同處理后基因的表達(dá)模式分析

利用獲取的冷、干旱、GA3和NAA處理毛竹及其對照中NPF基因的FPKM值，比較分析處理前后的基因表達(dá)變化情況。為有效地可視化展示基因表達(dá)量，用FPKM+1的值取以2為底的對數(shù)即Log2(FPKM+1)作為基因的表達(dá)量[30]。對所有表達(dá)量數(shù)據(jù)用TBtools軟件繪制表達(dá)譜熱圖，分析不同基因的表達(dá)情況，同時基于基因FPKM值對具有顯著差異(p＜ 0.05)表達(dá)的基因繪制點線圖。

2 結(jié)果分析

2.1 毛竹NPF家族基因成員鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

植物NPF蛋白通常含有PTR2保守結(jié)構(gòu)域，通過比對分析，在毛竹基因組中共鑒定到具有編碼完整PTR2的候選基因27個，其編碼蛋白均含有保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，符合MFS (Major Facilitator Superfamily)超家族的NPF家族的特征[31]。根據(jù)候選基因在毛竹Scaffold中的位置以及同源基因的名稱，依次命名為：PeNPF1.1～PeNPF8.8。

為確定PeNPFs與其它物種中已鑒定的NPF蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，預(yù)測其潛在功能，對毛竹、水稻和擬南芥NPF的氨基酸序列進(jìn)行了多重序列比對，并利用MEGA7.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明：所有毛竹、水稻和擬南芥的NPFs被聚類到8個亞家族(S1～S8)，PeNPFs成員分布在除S3之外的其它7個亞家族中，每個亞家族中成員數(shù)量不等，其中，亞家族S1、S4、S6分別只有1個成員，S8中的成員最多為8個，其余亞家族分別有3～7個成員不等(圖1)。

圖1 基于毛竹、水稻和擬南芥NPF氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on amino acid sequence of NPFs from moso bamboo, rice and Arabidopsis

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PeNPFs半數(shù)成員被聚類在S7 (7個)和S8 (8個)亞家族，而雙子葉植物擬南芥在這2個亞家族的成員分別只有3個和5個，在S5亞家族中，水稻和擬南芥NPF成員分別達(dá)到17個和16個，但僅包含6個毛竹成員。雖然NPF家族成員在功能上具有相似性，但不同亞家族成員在功能上也存在一定的差異，如AtNPF1.1和AtNPF1.2負(fù)責(zé)硝酸鹽向嫩葉的分配[32]，而OsNPF 2.4主要在表皮、木質(zhì)部薄壁細(xì)胞和韌皮部的伴胞中表達(dá)[33]。另外，所有PeNPFs均優(yōu)先與水稻NPF聚類在一起，說明在功能上PeNPFs或許與水稻等單子葉植物的同源基因相似。

2.2 PeNPFs基因結(jié)構(gòu)及啟動子分析

基因結(jié)構(gòu)分析表明，PeNPFs均有內(nèi)含子，數(shù)量為2～5個，單個內(nèi)含子在基因組上的跨度為33 bp(PeNPF7.6的第5個內(nèi)含子)～3 489 bp (PeNPF2.2的第2個內(nèi)含子)，而單個外顯子在基因組上的跨度為36 bp (PeNPF7.3的第1個外顯子)～1 601 bp(PeNPF7.3第3個外顯子) (圖2)。PeNPFs各個成員之間的內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量以及所在的位置存在一定的差異，這可能是影響其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的主要原因之一。

圖2 PeNPFs基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of PeNPFs

為更好地了解PeNPFs對外界環(huán)境的響應(yīng)和受內(nèi)在調(diào)控因子調(diào)節(jié)的情況，對PeNPFs的起始密碼子ATG上游2 000 bp的序列所含順式作用元件和應(yīng)答元件進(jìn)行分析。結(jié)果表明：所有序列中均含有啟動子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box。27個PeNPFs的啟動子序列中均包含多種參與基因表達(dá)調(diào)控的順式作用元件和外界刺激的應(yīng)答元件，如低溫響應(yīng)元件LTR，干旱響應(yīng)元件MBS和TCrich repeats，赤霉素響應(yīng)元件TATC-box、P-box和GARE-motif，生長素響應(yīng)元件TGA-element、AuxRR-core和AuxRE，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif，脫落酸響應(yīng)元件ABRE等(圖3)。由此表明，PeNPFs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能會受到非生物脅迫和激素的影響。

圖3 毛竹PeNPFs基因啟動子響應(yīng)元件種類統(tǒng)計Fig.3 Statistics of response elements in the promoter of PeNPFs

2.3 PeNPFs的保守基序分析

保守基序分析表明：在毛竹PeNPFs序列中共獲得10個保守基序，分別命名為motif 1～motif 10，其中，motif 1、motif 2和motif 4是27個PeNPFs共有的高度保守基序，而其它基序則在部分序列中缺失。27個PeNPFs中有15個成員含有10個motif，其它12個成員缺失1～3個motif，如PeNPF2.1、PeNPF4.1和PeNPF8.8缺少motif 3，PeNPF8.2缺少motif 5，PeNPF2.1缺少motif 6，PeNPF2.1、PeNPF7.5、PeNPF7.7、PeNPF8.2、PeNPF8.3和PeNPF8.8缺 少motif 7，PeNPF5.2、PeNPF5.5缺少motif 8，PeNPF7.6缺少motif 9，PeNPF5.1、PeNPF5.2、PeNPF5.3、PeNPF5.5缺 少motif 10(圖4A)。

另外，各motif在氨基酸組成的偏好性方面有一定相似性，如motif 1、motif 2和motif 4高度保守，均富含疏水性氨基酸，但各motif在氨基酸組成的偏好性方面也存在一定的差異，如motif 1富含亮氨酸，motif 2富含絲氨酸，motif 4富含甘氨酸(圖4B)。

2.4 編碼蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析

PeNPFs編碼氨基酸序列最長的為761 aa(PeNPF7.4)，最短的為452 aa (PeNPF8.8)，蛋白分子量介于49.56～82.08 kDa之間，理論等電點介于5.17～9.85之間，大部分是中性或堿性蛋白。親疏水性分析顯示，PeNPFs的親水性值(GRAVY)為0.063～0.607，推測它們屬于親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示，所有PeNPFs均定位于細(xì)胞膜或液泡中，其中，有8個成員在細(xì)胞膜和液泡中均有定位(表1)。

表1 PeNPFs編碼蛋白的基本特征Table 1 Basic characteristics of the proteins encoded by PeNPFs

2.5 PeNPFs的組織表達(dá)模式分析

利用毛竹7個不同組織的轉(zhuǎn)錄組測序(RNASeq)表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對PeNPFs的組織表達(dá)特異性進(jìn)行分析。結(jié)果(圖5)表明：在不同組織中，PeNPFs表達(dá)模式存在一定差異，其中，PeNPF5.3和PeNPF7.6在7個組織中均檢測到表達(dá)，且在7個組織中的表達(dá)量變化不大，呈組成型表達(dá)模式，它們可能與毛竹整個生長發(fā)育過程密切相關(guān)；而其它PeNPFs成員至少在1個組織中檢測到表達(dá)，但各成員的表達(dá)豐度差異較大，如在葉片中PeNPF2.3、PeNPF7.5、PeNPF7.7和PeNPF8.7的表達(dá)豐度較高；PeNPF-2.1、PeNPF5.6、PeNPF6.1、PeNPF7.1、PeNPF7.2和PeNPF8.2在早花期花序中表達(dá)豐度較高；PeNPF-1.1、PeNPF5.2、PeNPF5.6、PeNPF6.1和PeNPF8.1在盛花期花序中表達(dá)豐度較高。一些PeNPFs成員表現(xiàn)出組織特異性，如PeNPF4.1主要在竹鞭中表達(dá)；PeNPF5.1和PeNPF7.4主要在根中表達(dá)；PeNPF8.8主要在20 cm和50 cm高度筍中表達(dá)。PeNPFs在葉、花序、鞭和根等不同組織中的表達(dá)差異，表明它們在這些組織的生長發(fā)育中發(fā)揮著不同的功能。

圖5 PeNPFs在毛竹7個組織中的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of PeNPFs in seven tissues of moso bamboo

2.6 毛竹PeNPFs響應(yīng)非生物脅迫和激素脅迫的表達(dá)分析

啟動子調(diào)控元件分析表明：PeNPFs的表達(dá)可能會受到逆境脅迫的影響，因此，本文利用已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對冷和干旱處理下毛竹葉片中PeNPFs的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在冷和干旱處理的毛竹葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了18個PeNPFs的FPKM值，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)存在著一定的差異。與處理前(CK)相比，冷處理2 h后共有9個PeNPFs呈下調(diào)表達(dá)趨勢，9個PeNPFs呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(圖6A)；其中，下調(diào)表達(dá)的基因中有6個(PeNPF2.3、PeNPF5.3、PeNPF5.4、PeNPF7.2、PeNPF7.3和PeNPF8.7)呈顯著下調(diào)(p＜ 0.05)，而在上調(diào)表達(dá)的基因中僅有3個基因(PeNPF5.2、PeNPF7.1和PeNPF8.1)表現(xiàn)為顯著上調(diào)(p＜ 0.05) (圖6B)。在干旱處理2 h后共有15個基因呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢，僅有3個基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(圖6C)；其中下調(diào)表達(dá)的基因中有6個(PeNPF5.3、PeNPF7.2、PeNPF7.3、PeNPF8.1、PeNPF8.7和PeNPF8.8)呈現(xiàn)顯著下調(diào)(p＜ 0.05)，而上調(diào)基因的表達(dá)差異均不顯著(圖6D)。綜合分析發(fā)現(xiàn)，4個基因(PeNPF5.3、PeNPF7.2、PeNPF7.3和PeNPF8.7)在冷和干旱處理后均表現(xiàn)出顯著下調(diào)，這與其啟動子序列中存在與低溫和干旱響應(yīng)調(diào)控元件(圖2)相一致，推測它們可能在低溫和干旱響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

圖6 冷和干旱處理下PeNPFs的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of PeNPFs in moso bamboo under cold and drought treatments

另外，NPF基因的表達(dá)還受到激素的影響[34]，本文對GA3和NAA處理毛竹幼苗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中PeNPFs基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了18個PeNPFs的FPKM值，分析發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)在處理前后存在一定的差異。與處理前(CK)相比，18個PeNPFs在100 μmol·L-1GA3處理4 h后，各有9個基因呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)趨勢(圖7A)，其中，上調(diào)表達(dá)的5個基因(PeNPF4.1、PeNPF5.3、PeNPF5.4、PeNPF7.1和PeNPF7.6)，下調(diào)表達(dá)的3個基因(PeNPF2.1、PeNPF5.1和PeNPF7.3)的表達(dá)差異顯著(p＜ 0.05)(圖7B)；在5 μmol·L-1NAA處理4 h后，7個基因呈上調(diào)表達(dá)趨勢，11個基因呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(圖7C)，其中，PeNPF7.1和PeNPF7.3表現(xiàn)為顯著上調(diào)，而PeNPF2.2、PeNPF5.2和PeNPF7.6等基因表現(xiàn)為顯著下調(diào)(p＜ 0.05) (圖7D)。對比分析發(fā)現(xiàn)，PeNPF7.3和PeNPF7.6在2種激素處理后呈相反的表達(dá)變化，而PeNPF7.1的表達(dá)趨勢相同，推測這些基因在響應(yīng)激素方面可能發(fā)揮著不同的功能。

圖7 GA3和NAA處理下PeNPFs的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of PeNPFs in moso bamboo treated with GA3 and NAA

3 討論

NPF蛋白是MFS超家族中成員數(shù)量最多的家族之一，這些蛋白質(zhì)廣泛分布于真核生物和原核生物中，它對于植物、動物、酵母和細(xì)菌的氮代謝具有重要作用。本研究從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中，鑒定到27個NPF成員，這些成員均含有PTR2保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域，這可能是NPF家族成員具有吸收和轉(zhuǎn)運硝態(tài)氮的基礎(chǔ)。同一個亞家族內(nèi)的部分NPF成員間的基因結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位高度相似，如PeNPF8.6和PeNPF8.7的序列的相似性為86.83%，氨基酸長度相差3個，相對分子量、亞細(xì)胞位置、基因結(jié)構(gòu)、所含保守基序以及在7個組織中的表達(dá)模式相似。另外，部分NPF成員的基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位存在較大差異，如毛竹PeNPF5.1和PeNPF5.4序列的同源性為31.19%，氨基酸長度相差136個，二者的分子量分別為56.96 kDa和71.33 kDa，且二者在7個組織中的表達(dá)模式相反，這可能是由于非保守區(qū)的差異造成的，同時各成員序列非保守區(qū)的差異可能導(dǎo)致各個成員的功能具有多樣性[35]。

從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中，鑒定了27個PeNPFs成員，分別屬于7個亞家族，但沒有鑒定到S3亞家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，在其它物種(如水稻)中存在S3亞家族成員，推測本研究中沒有鑒定到S3亞家族成員的原因可能是所用的是毛竹基因組草圖，毛竹可能存在S3亞家族成員，作者將進(jìn)一步用最新的毛竹基因組進(jìn)行分析。同時，通過物種進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，聚類在同一個亞家族的成員可能具有相似的功能。在水稻和擬南芥中，S1、S2、S5、S6和S7亞家族成員的主要功能為轉(zhuǎn)運硝態(tài)氮，如OsNPF2.2負(fù)責(zé)根到地上部分硝態(tài)氮的運輸[36]，小麥TaNPF6.3負(fù)責(zé)硝態(tài)氮的吸收并調(diào)控非根系組織的硝態(tài)氮的分配[37]，AtNPF7.2和AtNPF 7.3分別負(fù)責(zé)硝態(tài)氮在木質(zhì)部的卸載和裝載[38]，推測毛竹在這5個分枝的成員可能也具有硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)運功能。另外，研究表明，AtNPF2.4和AtNPF2.5負(fù)責(zé)根中Cl-的轉(zhuǎn)運[39]，AtNPF5.2在脅迫條件下可以轉(zhuǎn)運二肽和三肽，AtNPF7.3還具有轉(zhuǎn)運K+的功能[40]，所以，也不排除相同亞家族中毛竹PeNPFs也具有一些其它功能?；蛟诓煌M織的表達(dá)模式是基因功能的重要體現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜表明，PeNPFs在毛竹各組織的功能存在差異，多數(shù)基因在葉片和花序中的表達(dá)量較高，在根和筍中的表達(dá)量相對較低。3個毛竹NPF基因具有組織特異性，PeNPF1.1只在盛花期花序中表達(dá)，PeNPF5.1只在根中表達(dá)，PeNPF8.8只在筍中表達(dá)，表明它們可能分別在盛花期花序、根以及筍中發(fā)揮著重要作用；而它們分別屬于不同的亞家族，說明各亞家族之間功能有一定的差異。擬南芥S8是小肽轉(zhuǎn)運體，AtNPF8.1和AtNPF8.2能夠轉(zhuǎn)運多肽，同時AtNPF8.3在開花和種子發(fā)育過程中將小肽轉(zhuǎn)出液泡，而毛竹S8成員中多個成員在花序發(fā)育時期的表達(dá)量較高，說明它們也可能參與毛竹開花發(fā)育時期小肽的轉(zhuǎn)運。

真核生物基因的表達(dá)受到多層次調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子能夠通過與基因的啟動子特定區(qū)域結(jié)合從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此，對基因的啟動子所含的調(diào)控元件進(jìn)行分析對于基因功能的預(yù)測具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，在PeNPFs中發(fā)現(xiàn)大量與逆境脅迫及激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件，這些元件已經(jīng)被證實在植物逆境脅迫[41]及植物生長與果實成熟等方面均發(fā)揮著重要作用。當(dāng)植物受到生物或非生物脅迫時，NPF基因通過上調(diào)或下調(diào)表達(dá)發(fā)揮其功能。冷處理后，18個PeNPFs中有9個PeNPFs的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化(上調(diào)或下調(diào))，說明毛竹在一定程度通過PeNPFs表達(dá)量變化來響應(yīng)冷處理；干旱處理后，18個PeNPFs中有15個基因的表達(dá)量下調(diào)，其中，6個與處理前差異顯著，這與干旱處理能顯著誘導(dǎo)小麥NPF基因表達(dá)量下調(diào)的結(jié)果一致[34]。在GA3處理4 h后18個PeNPFs均發(fā)生變化，其中，PeNPF4.1、PeNPF5.3、PeNPF5.4、PeNPF7.1和PeNPF7.6的表達(dá)量顯著上升，推測它們可能受GA3的誘導(dǎo)并通過表達(dá)量變化進(jìn)行響應(yīng)，這與施用GA3能夠增加ZmNRT2.1/2.2的表達(dá)水平相似[42]；NAA處理后，毛竹有5個基因發(fā)生顯著上調(diào)或下調(diào)，推測毛竹S7亞家族可能參與毛竹響應(yīng)NAA過程。毛竹中PeNPFs不同成員對GA3和NAA處理呈現(xiàn)不同程度、甚至相反的表達(dá)變化，表明各成員功能的差異，這與水稻中OsPTRs在GA3和NAA處理后的表達(dá)類似[4]。PeNPFs在毛竹中的具體功能和作用機(jī)制需要進(jìn)一步實驗驗證。

4 結(jié)論

本研究從毛竹基因組中共鑒定出27個PeNPFs基因，所有成員編碼的蛋白均包含完整的PTR2保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其蛋白序列差異分為7個亞家族，各亞家族成員之間的分子特征和組織表達(dá)特異性均存在著一定的差異，部分成員的表達(dá)表現(xiàn)為組織特異性或組成型表達(dá)。在PeNPFs啟動子序列中鑒定出多種與非生物脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件，冷、干旱以及GA3和NAA處理后毛竹的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜證明PeNPFs參與了不同程度的非生物脅迫和激素的應(yīng)答，研究結(jié)果為揭示PeNPFs的生物學(xué)功能提供了重要依據(jù)。但對于PeNPFs的研究尚在起步階段，其在毛竹中的具體功能尚需展開大量的實驗進(jìn)行驗證。